子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛甲基化状况的研究.doc

子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛甲基化状况的研究【关键词】 子宫内膜摘要 目的:检测子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化状况，分析其与临床病理特征之间的关系，探讨FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化在子宫内膜癌发生发展中的作用。方法:采用甲基化特异的PCR方法对亚硫酸氢盐修饰过的35例子宫内膜癌组织、癌旁组织及患者自身外周血白细胞DNA和20例非癌患者子宫内膜组织DNA的FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化状况进行分析。结果:癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化率为25.71%，癌旁组织和外周血中也存在相似的甲基化率。非癌患者的子宫内膜组织中FHIT基因的CpG岛无甲基化。癌组织与非癌患者子宫内膜组织的甲基化率之间的差异有统计学意义（P0.05）。DNA甲基化与临床病理特征之间无相关性。FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化为子宫内膜癌发生中的早期事件。结论:子宫内膜癌组织中存在FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化，CpG岛的甲基化与临床病理特征之间无相关性。DNA甲基化为子宫内膜癌发生中的早期事件。癌旁组织和外周血可用于癌相关基因启动子区域CpG岛甲基化的检测。 关键词 子宫内膜癌;肿瘤抑制基因;DNA甲基化;MSP;FHIT 子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年在世界范围内呈上升趋势 1 。从分子水平探讨子宫内膜癌的发病机制，是近年来妇科肿瘤研究中的热点。现有研究 2 已确切证明DNA甲基化是肿瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSGs）失活的第三种机制，而且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制。为此，我们对子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化（简称启动子甲基化）状况进行检测，以分析探讨其在子宫内膜癌的发生发展中的作用。 1 资料与方法 1.1 临床资料 选取山东大学齐鲁医院妇科2003年1月2003年10月间临床病理资料完整的35例子宫内膜癌手术病人的子宫内膜癌组织标本，病理类型参照国际妇科病理协会（ISGP）1988年制定的标准分为:子宫内膜样腺癌27例占77.14%，非腺癌8例占22.86%（透明细胞癌4例，腺鳞癌3例，未分化癌1例）。手术-病理分期和病理分级按国际妇产科联盟（FIGO）1988年制定的标准分为:期24例占68.57%（a期2例，b期18例，c期4例），期11例占31.43%（a期6例，c期5例）;G 1 12例占34.29%，G 2 14例占40.00%，G 3 9例占25.71%。绝经前患者5人占14.29%，绝经后患者30人占85.71%。所有患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗。子宫内膜癌患者的发病年龄为43岁73岁，平均年龄（57.66.9）岁，中位年龄57岁。35例子宫内膜癌中，12例同时采集了癌旁正常组织，其余23例则提取自身外周血白细胞DNA，同时用于甲基化检测。另收集功血或不孕症患者刮宫所得的子宫内膜组织标本20例用作正常对照，其年龄为25岁59岁，平均（41.913.6）岁。对照组子宫内膜组织的病理类型包括月经期、增生期、分泌期子宫内膜和单纯性增生子宫内膜。所有病理诊断均由同一名病理学专家复查并核实。 1.2 实验方法 1.2.1 标本的留取和DNA的提取:肿瘤患者的组织标本于术中子宫离体后即刻按无菌原则采集，并立即冻存于-80冰箱中待用。抗凝外周血采集后立即离心，使之分为血浆和白、红细胞三层后-80冻存。刮宫所得子宫内膜组织标本也于术后立即采集并于-80冻存。组织标本DNA的提取方法按Roche公司High Pure PCR Template Prepa-ration Kit的说明和程序操作，外周血标本DNA的提取按Qiagen公司的产品说明和程序操作。 1.2.2 DNA的修饰方法:每份样本取1g/100L的DNA100L按Intergen公司的CpGenome DNA Modification Kit说明和程序对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。 1.2.3 甲基化特异性PCR（MSP）:12.5L热启动PCR的反应体系包括去离子水，10PCR buffer，2.5mM MgCl2，2.5mM dNTP，Ampli Taq-Gold酶（PE公司，5u/L）及修饰过的DNA模板。PCR循环参数为:预变性，95，10min;变性，94，30s;退火，68，45s;延伸，72，45s;45个循环后，72延伸10min。引物（由香港中文大学癌症中心惠赠）序列为:甲基化引物 M -F:TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC，M-R:CGTAAACGACGCCGACCCCACTA;非甲基化引物U-F:TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG，U-R:CATAAACAACACCAACCCCACTA。PCR产物长度:非甲基化产物（U）和甲基化产物（M）均为74bp 3 。 1.2.4 电泳分析:用1TBE缓冲液制备高解像度的3%琼脂糖凝胶（Agarose-1000，Invitrogen公司产品）并加入溴乙锭（EB），取10L PCR产物在60V100V电压下水平电泳1h2h，数字凝胶分析仪中观察结果并拍照。 1.2.5 统计学方法:采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，对甲基化率的比较采用检验 2 、矫正 2检验或计算Fisher精确概率，P值0.05时有统计学意义。 2 结果 2.1 不同组织中FHIT基因启动子的甲基化频率 35例子宫内膜癌组织中，FHIT基因启动子的甲基化率为25.71%（9/35），13例癌旁组织中的甲基化率为23.08%（3/13），22例外周血白细胞DNA中的甲基化率为22.73%（5/22）。癌患者的不同组织中FHIT基因启动子的甲基化率比较无统计学差异，但与正常对照组的子宫内膜组织中未检测到该基因启动子的甲基化相比，差异有显著性，见表1。提示了甲基化的肿瘤特异性及癌患者自身非癌组织与癌组织甲基化的一致性。见图1、2。 2.2 FHIT基因启动子的甲基化率与临床病理特征之间的关系 2.2.1 FHIT基因启动子的甲基化率与雌激素水平的关系:FHIT基因启动子的甲基化率在绝经前组中为40%（2/5），在绝经后组中为23%（7/30），二者比较无统计学差异（P=0.586），见表2。 表1 不同组织中FHIT基因启动子的甲基化率及比较（略） a: 2 检验;b:矫正 2 检验，c:Fisher精确概率。 表2 FHIT基因启动子的甲基化率与临床病理特征之间的关系（略） P值为Fisher精确概率。 图1:癌患者标本的MSP结果（略）图2:正常对照组的MSP结果（略） U表示非甲基化的PCR产物，M表示甲基化的PCR产物，H 2 O（水）用做阴性对照，图左侧的数字表示Marker（174DNA/Hinf）的片段大小，右侧的数字表示MSP产物的大小。 2.2.2 FHIT基因启动子的甲基化率与病理类型之间的关系:FHIT基因启动子的甲基化率在腺癌中为33%（9/27），在非腺癌中为0%（0/8），二者比较无统计学差异（P=0.081），见表2。 2.2.3 FHIT基因启动子的甲基化率与手术-病理分期之间的关系:FHIT基因启动子的甲基化率在期患者中为25%，在期患者中为27%，二者比较无统计学差异（P=1.0），见表2。 2.2.4 FHIT基因启动子的甲基化率与病理分级之间的关系:FHIT基因启动子的甲基化率在G 1 中为33%，在G 2 和G 3 中为22%，高分化（G 1 ）和中低分化（G 2 +G 3 ）比较无统计学差异（P=0.685），见表2。 3 讨论 3.1 子宫内膜癌发生的分子机制 恶性肿瘤的发生，包括癌基因的激活、TSGs的失活等多种基因发生改变。既往认为，抑癌基因失活有两条途径:基因突变和染色体物质丢失。现已证明，DNA甲基化是TSGs失活的第三种机制 2 。本研究利用甲基化特异的聚合酶链反应（Methyla-tion specific PCR，MSP）对子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子的甲基化状况进行检测，以探讨甲基化是否参与了子宫内膜癌的发生发展。FHIT基因被认为是一种候选的抑癌基因，其编码的Fhit蛋白可能通过诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞而发挥抑制肿瘤增殖的作用 4 。有研究报道 3，5，FHIT基因启动子的甲基化在食管癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织及相应的细胞株中是一频发事件，是FHIT mRNA和Fhit蛋白失表达的重要机制。 3.2 FHIT基因启动子甲基化与子宫内膜癌 本研究结果提示:FHIT基因启动子的甲基化具有肿瘤特异性，癌患者自身非癌组织与癌组织的甲基化具有一致性;FHIT基因启动子甲基化的出现与发病年龄和体内的雌激素水平及肿瘤进展无关，是子宫内膜癌发生中的早期的独立于雌激素的表遗传学（Epigenetics）事件，在子宫内膜的发生中可能起重要作用。本研究发现，FHIT在腺癌中的甲基化率较非腺癌中的要高，但因各种类型的非腺癌例数较少，是否反应了FHIT的甲基化有组织类型特异性还有待进一步的大样本研究。 3.3 癌旁组织与外周血白细胞中FHIT基因启动子甲基化的意义 由于癌患者自身非癌组织与癌组织的甲基化具有一致性，作者认为，癌旁组织和外周血中FHIT基因甲基化的出现代表了一种癌前的分子水平的变化，尤其外周血白细胞中该基因甲基化的出现代表了正常体细胞的表遗传学改变，即在子宫内膜癌出现以前，患者的体细胞中已有了该基因的变化。尽管研究中发现癌旁组织或外周血中该基因甲基化的出现与癌组织中并不完全吻合，作者认为癌组织中未出现相应基因的甲基化，可能是在癌前病变向癌的演进过程中，继发有其他的分子水平的改变，如点突变和（或）杂合性缺失，故仅能在癌旁组织中检出相应基因的甲基化。因此，甲基化是抑癌基因失活的“二次打击”中的其中“一次打击”，为基因失活的原因之一。 3.4 DNA甲基化研究的意义 基因启动子区域CpG岛的异常甲基化是TSGs和其他肿瘤相关基因沉寂（silence）的原因之一。大量研究显示，基因启动子异常甲基化在多种肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件。由于抑癌基因甲基化的出现早于形态学的改变，而癌旁组织和外周血白细胞DNA中抑癌基因的甲基化又可以反映癌组织中的变化，但癌患者的非癌组织要比癌组织容易获得的多，这就为患者的诊断尤其是早期癌患者的诊断提供了重要的依据。本研究的结果提示，外周血或癌旁组织可用于癌相关基因甲基化的检测。值得注意的是，肿瘤相关基因的表遗传学改变是一种可逆的过程，通过DNA甲基化抑制剂（如5-aza-dc等）可使之去甲基化而发生逆转，特别是对癌变早期的表遗传学改变。这就为恶性肿瘤的预防和治疗提供了一种新的思路、方法和靶点。 参考文献 1.DISAIA CREASMAN.Clinical Gynecological Oncology.北京:人民卫生出版社，2002，137 2.Jones PA，Laird PW.Cancer epigenetics comes of age.Nat Genet，1999，21（2）:163167 3.Zchbauer-Mller S，Fong KM，Maitra A，et al.5CpG island methylation of the FHIT gene is correlated with loss of gene expression in lung and breast cancer.Cancer Res，2001，61（9）:358135854.Sard L，Accornero P，Tornielli S，et al.The tumor-suppressor gene FHIT is involved in the regulation of apoptosis and in cell cycle control.Proc N