蛋白质芯片技术课件.ppt

蛋白质芯片研究进展 SeminarI 内容提要 蛋白质芯片概述蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的应用展望 蛋白质芯片的定义 蛋白质芯片 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列 是指以蛋白质分子作为配基 将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列 用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用 洗去未结合的成分 经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度 来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系 MarkusF etal DDT 2002 7 815 822 BertoneP etal FEBSJournal 2005 272 5400 5411 研究蛋白质芯片的意义 蛋白质是基因表达的最终产物 接近生命活动的物质层面 探针蛋白特异性高 亲和力强 可简化样品前处理 甚至可直接利用生物材料 血样 尿样 细胞及组织等 进行检测 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物 有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用 蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的分类 PoetzOet al MechanismsofgeingandDevelopment 2005 126 161 170 蛋白质芯片的关键技术 提出生物学问题 实验目的 样品预处理 重组蛋白 制备一 二级抗体 荧光标记 配蛋白印记缓冲液 生化反应化学偶合 加底物 反应温度和时间 冲洗条件 检测 荧光和比色扫描或拍照 参数设置 数据分析和建模 图象量化 标准化 采集蛋白信息 建立模型 1 2 3 4 5 蛋白质芯片制备 6 SchenaM Proteinmicroarrays 2005 7 蛋白质芯片的制备 固相载体及其处理载体 滴定板 滤膜 凝胶 载玻片 蛋白质的预处理选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等 固定微阵列上的蛋白样点膜为载体 芯片放入湿盒 37 C1h载玻片为载体 化学修饰产生醛基固定蛋白微阵列的封闭主要封闭试剂 BSA或Gly 李瑶 基因芯片与功能基因组 2004 32 33 蛋白质芯片比较 表面蛋白固定方式优点缺点 PVDF吸附无需蛋白修饰过程 高结合容量非特异吸附 分布随机Nitrocellulose吸附无需蛋白修饰过程 高结合容量非特异吸附 高背景 低密度无需蛋白修饰过程 高密度 非特异吸附 分布随机高分辨检测Epoxy activated高密度 高分辨检测分布随机 表面有吸附PDMSnanowell高密度 适合复杂的生化分析Goldcoatedsilicon高密度 低背景 易与SPR或MS联用分布随机 制作难 未商品化Avidincoated亲和结合蛋白连接强度高 特异和高密度 低背景蛋白需生物素化Ni NTAcoated亲和结合蛋白连接强度高 特异和高密度 低背景蛋白需Hisx6标记表面蛋白分布均一容量Agarosethinfilm制作难 未商品化3Dgelpad 吸附 共价偶联 Poly lysinecoatedAldehyde coated 共价偶联 扩散无需蛋白修饰过程 高结合容量 ZhuHet al CurrentOpinioninchemicalBiology 2003 7 55 63 蛋白质芯片检测 探针标记检测法 无探针标记检测法 表面增强激光解吸离子化技术 Surfaceenhancedlaserdesorption ionization SELDI 表面等离子体共振检测技术 surfaceplasmonresonance SPR 原子力显微镜检测技术 atomicforcemicroscope AFM 同位素标记检测荧光标记检测化学发光检测酶免疫标记检测胶体金标记检测 蛋白质芯片的应用 疾病诊断和预警药物开发蛋白质组学 定量检测组织提取液中的肿瘤标记物 WeissensteinU Proteomics2006 6 1427 1436 孵育后的微阵列荧光图A含抗原B无抗原 微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 疾病诊断 uPA尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI 1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGT血管内皮生长因子 2020 1 30 12 可编辑 高通量筛选蛋白 蛋白作用抑制剂 药物开发 JungSO etal Proteomics2005 5 4427 4431 A1500个点阵的微阵列B局部点阵放大图及SPR信号 His6 RB GST E7相互作用抑制剂筛选微阵列图 加入His6 RB 加入含PepC抑制剂的His6 RB 人动脉平滑肌细胞蛋白谱 SukhanovSandDelafontaineP Proteomics 2005 5 1274 1280 蛋白质组学 揭示了oxidizedlowdensitylipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 细胞经oxidizedlowdensitylipoprotein作用后的蛋白谱 检出298个蛋白54个蛋白表达量发生变化 4 7 抗原 一组细胞 细胞间相互作用分子 表达上调 13 4 抗原 结构蛋白 体液响应蛋白 表达下降 存在的问题 成本过高 需一系列昂贵的尖端仪器芯片的标准化问题提高芯片的特异性 简化样品制备和标记操作程序 增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等 展望 蛋白质芯片未来的发展重点 建立快速 廉价 高通量的蛋白质表达和纯化方法 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合 提高芯片制作的点阵速度 提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性 研究通用的高灵敏度 高分辨率检测方法 实现成像与数据分析一体化 参考文献 1 MarkusF etal DDT 2002 7 815 822 2 BertoneP etal FEBSJournal 2005 272 5400 5411 3 PoetzOet al MechanismsofgeingandDevelopment 2005 126 161 170 4 李瑶 基因芯片与功能基因组 2004 32 33 5 ZhuHet al CurrentOpinioninchemicalBiology 2003 755 63 6 WeissensteinU Proteomics2006 6 1427 1436 7 FangY etal ChemBioChem2002 3 987 991 8 SukhanovSandDelafontaineP Proteomics 2005 5 1274 1280 9 JungSO etal Proteomics2005 5 4427 4431 10 SchenaM Proteinmicroarrays 2005 7 谢谢 蛋白质芯片检测信号的提高 SaueraU etal SensorsandActuatorsB 2005 107 178 183 优化芯片制作过程各种参数 使用金粒子作为辅助标记分子 添加SiO2和TiO2层提高表面反射 Au labelledanti rabbitIgG放大照片 Au的尺寸及其与Dy633的比例对信号的影响5nmAu particle10nmAu particle ProteinMicroarraySystem TheProteinMicroarraySystemisacompletemicroarrayplatformthatincludesmicroarraymanufacturing processing surfacechemistry detectionandanalysis TeleChem ItissuitableforavarietyofproteomicapplicationsincludingMicroMultianalyteImmunoassays protein antibody antibody protein antibody antigen protein protein