各种PCR介绍课件.ppt

聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction 根据细胞分裂中DNA半保留复制机理 在体外快速扩增某一特定DNA片段的方法 PCR工作原理 以要扩增的DNA分子为模板 以一对与模板5 末端和3 末端互补的寡核甘酸片段为引物4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下依赖DNA聚合酶的酶促合成反应 PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性 体外 试管中 扩增特异DNA片段短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上 PCR技术特点敏感度高 特异性强 产率高 重复性好 操作简便 快速 PCR体系基本组成 模板DNA 102 5 拷贝dNTP底物 20 200umol L特异性引物 0 1 0 5umol LDNA聚合酶 KlenowT4 T7聚合酶TaqDNA聚合酶 耐热稳定性 5 3 聚合酶活性及3 5 外切酶活性 可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配 含Mg2 的缓冲液 Mg2 能影响反应特异性和扩增片段的产率 一般为1 5 2 0mmol L 过量将增加非特异性条带的产生 循环次数取决于模板DNA的浓度30次 扩增100万倍 反应分三步 1变性denaturation 加热90 95 模板DNA双链解离形成单链DNA 2退火annealling 温度突然降低 引物与模板DNA结合 40 60 Tm值 4 G C 2 A T 5 3延伸extension TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物 在Mg2 存在的条件下 催化DNA合成 70 75 时间 要扩增片段长度决定 待扩增片段 1000bp引物Tm 55 DNA模板变性 94 5分钟 PCR循环 30次 94 30秒 50 45秒 72 1分钟 最终延伸 72 10分钟 PCR反应条件的设定 PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳 分子杂交 限制性内切酶酶切分析 微孔板夹心杂交法 直接测序 PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物 PCR产物 PCR技术的应用1 基础研究 1 基因或cDNA克隆 从基因数据库中获得某一基因或cDNA的核苷酸序列 用PCR方法扩增并克隆该基因或cDNA 2 基因表达 用RT PCR检测某一特定基因在转录水平的表达 2 医学 1 感染性疾病病原体的诊断 HIV 结核分枝杆菌 乙肝病毒等 2 遗传病相关基因的检测 镰刀型细胞贫血 血友病 3 恶性肿瘤的诊断3 基因动 植物的检测 1 转基因动物的检测 检测某一基因的遗传稳定性 2 转基因植物的检测 玉米 大豆等 PCR新技术 RT PCR 用于RNA分析梯度PCR 可用于找出最适合的退火温度反向PCR 可对未知序列扩增后进行分析不对称PCR 用于制备单链DNA多重PCR 加上二对以上引物 同时扩增出多个核酸片段降落PCR 用于PCR条件的优化 避免非特异性序列的扩增实时定量PCR RealTimeQuantitativePCR qRT PCR 巢式PCR 使用两对 而非一对 PCR引物扩增完整的片段 反转录PCR RT PCR RT PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起 提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法 5 3 AAAAA 5 3 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 RT PCR原理 mRNA 1stcDNA 逆转录酶 下游引物 dNTPs TaqDNA聚合酶 上游及下游引物 dNTPs 5 5 3 3 特异PCR产物 5 5 3 3 经30个循环 产生230个分子拷贝 5 5 3 3 2020 1 30 15 可编辑 一步法RT PCRRT反应与PCR反应在同一个试管中进行 两步法RT PCRRT反应与PCR反应在不同的试管中进行 下游引物特异性引物Oligo dT 降落PCR TouchdownPCR 用来避免非特异性序列的扩增 PCR中引物的黏合温度 annealingtemperature 决定了黏合的特异性 温度越高特异性越强 但过高则不能实现引物和模板的结合 而过低会产生大量非特异性产物 因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度 降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度 每个循环黏合温度下降1 到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束 在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时 可以达到最高的特异性 这样在起初的几个循环中 特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍 从而减轻非特异性扩增对结果的干扰 这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作 反向PCR InversePCR IPCR 扩增引物相反方向DNA序列的技术 用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段 而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段 实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切 然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接 再用一对反向的引物进行PCR 其扩增产物将含有两引物外未知序列 从而对未知序进行分析研究 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析 探索邻接已知DNA片段的序列 并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆 建立全长的DNA探针 1 用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶消化大分子量的DNA2 产生的大小不同的线性DNA片段群体 其中具靶DNA区段的DNA分子长度不超过2 3Kb 经连接后环化成环状分子3 按靶序列设计的一对向外引物同靶序列5 端互补序列退火结合 其延伸方向如图中箭头所指4 经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子 它是由左侧的序列和右侧序列首位连接而成 其接点就是限制酶的识别位点 不对称PCR asymmetricPCR 用于制备单链DNA PCR扩增所用的两条引物中 浓度受限制的只及高浓度的1 或2 经过PCR循环直到限制引物耗尽之前 扩增的引物是双链的DNA序列 而后 反应混合物中的另一种高浓度的引物 则利用限制引物合成的DNA链做模板 继续引导DNA合成 这样模板链继续再循环 由高浓度的引物合成的DNA要比限制引物多得多 而且仍保持单链状态 多重PCR 一般PCR仅应用一对引物 通过PCR扩增产生一个核酸片段 主要用于单一致病因子等的鉴定 多重PCR multiplexPCR 又称多重引物PCR或复合PCR 它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物 同时扩增出多个核酸片段的PCR反应 其反应原理 反应试剂和操作过程与一般PCR相同 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物 某些遗传病及癌基因的分型鉴定 梯度PCR GradientPCR 是指我们在摸PCR条件的时候采取的一种手段 因为不能确认引物的最佳退火温度 会采用梯度PCR 同时在不改变其他PCR条件的情况下 对目的基因使用不同的退火温度 最终找到一个适合目的基因的退火温度 在这里 每个PCR反应管只有一个退火温度 实时荧光定量PCR技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 实时荧光定量PCR原理 指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 特异性更强 有效解决PCR污染 自动化程度高 实时监测反应过程 Ct值的定义 在荧光定量PCR技术中重要概念 Ct值C代表Cycle t代表threshold Ct值 每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数 Ct值与起始模板的关系 每个模板Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 Ct值越小 利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线 横坐标起始拷贝数的对数 纵坐标代Ct值 只要获得未知样品的Ct值 即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数 巢式PCR NestedPCR 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应 PCR 使用两对 而非一对 PCR引物扩增完整的片段 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似 第二对引物称为巢式引物 因为他们在第一次PCR扩增片段的内部 结