合成肽S247-预先给药对大鼠呼吸机相关性肺损伤的影响.doc

合成肽S247预先给药对大鼠呼吸机相关性肺损伤的影响作者单位：430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉 430022桂平 武庆平 姚尚龙【摘要】 目的 研究合成肽S247预先给药对大鼠呼吸机相关性肺损伤（VILI）的影响及其机制。方法 24只雄性SD大鼠随机分为3组（n=8），对照组（C组）：不进行机械通气；高潮气量组（H组）：潮气量40ml/kg，呼气末正压0 cmH2O ，呼吸频率40次/min，吸入氧浓度21；S247预先给药组（S组）：腹腔注射S247 100mg.kg-1.d-1 1次/d，持续2周，在最后一次注射30min后开始机械通气，机械通气的参数设定同H组。C组和H组在相同的时间点注射等量的生理盐水。机械通气4h后放血处死大鼠，取肺组织，光镜下观察肺病理变化，测定肺湿/干重比（W/D），免疫组化检测转化生长因子-1（TGF-1）的表达；收集支气管肺泡灌洗液（BALF），测定总蛋白（TP）含量、肿瘤坏死因子（TNF-）和巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）的浓度，并进行白细胞（WBC）计数。 结果 与C组比较，H组和S组W/D、WBC计数、TP含量和TGF-1的表达升高（P0.01），H组MIP-2的浓度升高(P0.01)并且肺组织病理学改变严重；与H组比较，S组W/D、WBC计数、TP含量、TNF-和MIP-2浓度和TGF-1的表达降低(P0.01或0.05)，肺组织病理学改变明显减轻。结论 S247预先给药可减轻大鼠VILI，其机制与抑制了TGF-1的激活有关。【关键词】 呼吸窘迫综合征，成人；呼吸，人工；转化生长因子-1Effect of synthesized peptide S247 pretreatment on ventilator-induced lung injury in rats WU Qing-ping Department of Anesthesiology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huangzhong University of Science and Technology , Wuhan 430022 , China【Abstract】 Objective To investigate the effect of synthesized peptide S247 pretreatment on ventilator-induced lung injury(VILI) and its possible mechanism . Methods Twenty four male SD rats weighing 250-313g were randomly divided into 3 group(n=8 each) : control group(group C): no mechanical ventilation; high tidal volume group(group H): 40ml/kg tidal volume , 0 cmH2O of positive end-expiratory pressure , 40 breaths/min and FiO2=0.21; S247 pretreatment group(group S): Rats in group S received intraperitoneal injection of S247 one time every day(100mg.kg-1.d-1) and the treatment lasted for two weeks . Mechanical ventilation started 30min after the last injection and mechanical ventilation settings were the same as group H .Rats in group C and group H were injected with equal volume of normal saline at the same time . The animals were sacrificed by exsanguination at the end of 4h mechanical ventilation . The lungs were removed for (1) microscopic examination , measuring wet-to-dry weight ratios(W/D) and determination of transforming growth factor-1(TGF-1) expression , and (2) broncho-alveolar lavage and determination of total protein(TP) contents , TNF- and MIP-2 concentrations and WBC counts in broncho-alveolar lavage fluid(BALF) . Results Group H showed serious histopathologic damage and the damage of group S was less pronounced . W/D , WBC counts , TP contents and TGF-1 expression in group H and group S and MIP-2 concentration in group H were significantly higher than in group C(P0.01). W/D , WBC counts , TP contents , concentrations of TNF- and MIP-2 and TGF-1 expression in group S were significantly lower than in group H(P0.01 or 0.05). Conclusion Pretreatment with S247 can significantly inhibit the activation of TGF-1 and attenuate VILI in rats.【Key words】 Respiratory distress syndrome , adult; Respiration , artificial; Transforming growth factor-1机械通气是临床救治呼吸功能严重受损病人一种必不可少的治疗手段，但使肺受到了过度的机械牵拉。过度的机械牵拉会破坏肺的结构，影响气体交换和激活炎症反应，导致呼吸机相关性肺损伤（VILI）的发生。其重要的组织病理学特点为水肿，白细胞渗出和肺泡毛细血管膜的破坏1。转化生长因子-1（TGF-1）在体外能增加肺上皮细胞的通透性，在体内药物性抑制TGF-1可以显著减轻脂多糖（LPS）诱导的小鼠肺损伤时肺水肿程度2。S247是一种人工合成的小分子多肽，能竞争性抑制TGF-1的激活。S247是否能减轻VILI尚需要进一步探讨。本研究拟观察S247预先给药对大鼠VILI的影响，为临床研究提供依据。1 材料与方法1.1 动物及分组：清洁级雄性SD大鼠24只，体重250313g，随机分为三组，每组8只。对照组（C组），高潮气量组（H组）和S247预先给药组（S组）。S组大鼠腹腔注射S247 100mg.kg-1.d-1 1次/d，持续2周，在最后一次注射30min后开始机械通气。C组和H组大鼠在相同的时间点注射等量的生理盐水。粉末状的S247（上海英骏生物技术有限公司）注射前用生理盐水稀释成20mg/ml。1.2 VILI动物模型的制备：H组和S组的大鼠腹腔注射20的乌拉坦1.3g/kg麻醉，利用额镜，直视下经口插入气管导管（用16号静脉套管针代替），口腔填塞细纱布条以防止漏气，连接到683型小动物容量控制呼吸机（Harvard Apparatus公司，美国）行机械通气，潮气量40ml/kg，呼吸频率40次/min，呼气末正压0 cmH2O，吸入氧浓度21，通气时间为4h。股静脉置管，乳酸钠林格氏液以3ml/h的速度持续静脉输注。颈动脉置管，1205A监测仪（hp公司，美国）监测心率和平均动脉压。通气过程中动物保持仰卧位，通气结束后颈动脉放血处死。C组大鼠不进行机械通气。1.3 标本制备：机械通气后4h，放血处死大鼠。小心分离左右两侧肺组织，结扎右主支气管，4生理盐水4ml分两次注入气管，轻轻回抽，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），低温离心（1200g，4，10min），上清液等分后-70保存，用于测定总蛋白（TP）含量、肿瘤坏死因子（TNF-）和巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）的浓度，沉淀物用于白细胞（WBC）计数。分离右肺上叶用于测定肺湿/干重比（W/D）。分离右肺中叶，4多聚甲醛固定，用于观察肺组织病理学改变和免疫组化检测TGF-1的表达。1.4 检测指标及方法：（1）W/D：右肺上叶称重后，置于70的烤箱烘烤直至恒重，计算W/D。（2） BALF WBC计数：BALF离心沉淀物用PBS稀释后光镜下行WBC计数（3）BALF TP含量：用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce公司，美国）按说明书进行操作。（4）BALF TNF-和MIP-2浓度：用ELISA试剂盒（Biosource公司，美国）按说明书进行操作。（5）肺组织病理学改变：右肺中叶石腊包埋，切片，一部分切片HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变。（6）肺组织TGF-1表达：另一部分切片用于免疫组化法检测肺组织TGF-1表达，兔抗大鼠TGF-1多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品，按试剂盒说明操作，DAB染色，阳性染色为胞浆染成棕黄或棕褐色。阴性对照采用PBS代替一抗。每张切片随机选取5个视野（200），图象采用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统（华中科技大学同济医学院图象分析室）进行蛋白半定量分析，以光密度反映TGF-1蛋白含量。1.5 统计学方法：采用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料以均数标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 病理学改变：C组肺泡结构完整，肺泡腔清晰；H组肺泡结构严重破坏，肺泡腔内出血、渗出物和间质水肿明显；S组肺泡结构尚存，肺泡间隔有一定程度的增宽，肺泡腔内出血和渗出物较H组明显减轻。2.2 W/D，BALF WBC计数、TP含量、TNF-和MIP-2浓度：与C组比较，H组和S组W/D、WBC计数、TP含量升高，H组MIP-2的浓度升高（P0.01），与H组比较，S组W/D、WBC计数、TP含量、TNF-和MIP-2浓度降低（P0.01或0.05），见表1。表 1 三组W/D、WBC 计数、TP含量和细胞因子浓度的比较（n=8 , ）组别W/DWBC(/ml)TP(g/l)TNF-(pg/ml)MIP-2(pg/ml)C组4.430.111 7802481.20.3-538H组5.370.09*19 9671 894*9.60.7*1311310419*S组4.600.10*#12 3502 475*#7.10.6*#11114688#与C组比较，*P0.01 与H组比较，#P0.01 P0.052.3 肺组织TGF-1表达：C组肺泡上皮呈弱阳性染色，H组肺泡上皮呈强阳性染色，S组肺泡上皮染色明显减弱，见图1。C组，H组和S组的光密度值分别为：0.1020.012，0.3010.015和0.1560.010。与C组比较，H组和S组TGF-1表达升高（P0.01）；与H组比较，S组TGF-1表达降低（P0.01）。图 1 三组肺组织TGF-1的免疫组化检测（DAB染色，200）3 讨论VILI是机械通气严重的并发症之一，其组织病理学特征为水肿，白细胞渗出和肺泡毛细血管膜的破坏。本研究采用高潮气量机械通气建立VILI大鼠模型参考了王月兰等的研究3，H组肺泡结构严重破坏，肺泡腔内出血、渗出物和间质水肿明显，W/D、BALF WBC计数、TP含量、TNF-和MIP-2浓度都显著高于C组，表明VILI模型建立成功。本研究发现H组肺上皮细细胞TGF-1的表达较之对照组显著增加。有研究表明LPS、TNF-、IL-1和IL-8并不能使肺上皮细胞（A549细胞）表达TGF-1增加4，但氧自由基和H2O2能显著增加其表达，这与转录因子AP-1的激活有关5，6。VILI时肺泡腔大量的WBC聚集，WBC氧化酶（NADPH氧化酶）使还原型辅酶（NADPH）氧化而产生超氧阴离子，后者经自发性歧化作用转变为H2O2，这可能是VILI时肺上皮细细胞TGF-1表达显著增加的原因。S组BALF WBC计数介于C组和H组之间，故S组肺上皮细细胞TGF-1的表达水平也介于两者之间。TGF-1在体外可以通过衰竭肺泡上皮细胞内的谷胱苷肽而增加其通透性，在体内药物性抑制TGF-1可以显著减轻LPS诱导的小鼠肺损伤时肺水肿程度2。TGF-1要发挥生物学效应，首先需要被激活。肺上皮细胞整合素v6和v8能结合到TGF-1前体相关肽的精氨酸甘氨酸天冬氨酸（RGD）位点通过两种不同的方式将其激活7，8。S247是一种人工合成的含RGD序列的小分子多肽，它是v整合素的非特异性阻断剂，能与细胞外基质中含RGD序列的整合素配体竞争结合于该类整合素9。S247预先给药能竞争性抑制TGF-1的激活，减轻VILI时肺上皮细胞的通透性和肺水肿的程度，所以S组肺病理学改变显著轻于H组，W/D、BALF WBC计数、TP含量、TNF-和MIP-2浓度显著低于H组。S247并不直接减少肺上皮细胞TGF-1的表达，S组TGF-1表达较H组减少是肺泡上皮细胞通透性降低后BALF WBC计数下降的结果。S组的损伤并不能降到C组的水平，这一方面可能是由于S247预先给药量不是防治VILI的最适剂量，另一方面可能是由于VILI的发病机制复杂，S247只是干预了其中部分机制。综上所述，S247预先给药能减轻大鼠VILI,其机制与抑制了TGF-1的激活有关。参考文献1 BELPERIO JA , KEANE MP , LYNCH JP 3RD , et al . The role of cytokines during the pathogenesis of ventilator-associated and ventilator-induced lung injuryJ . Semin Respir Crit Care Med , 2006 , 27(4):350-364 .2 PITTET JF , GRIFFITHS MJ , GEISER T , et al . TGF-beta is a critical mediator of acute lung injuryJ . J Clin Invest , 2001 , 107(12):1537-1544 .3 王月兰 , 姚尚龙 . 丝裂原蛋白激酶信号转导通路在机械通气相关性肺损伤中的作用J . 中华实验外科杂志 , 2006 , 23(3):331-333 .4 KWONG KY , LITERAT A , ZHU NL , et al . Expression of transforming growth factor beta (TGF-beta1) in human epithelial alveolar cells: a pro-inflammatory mediator independent pathwayJ . Life Sci , 2004 , 74(24):2941-2957 . 5 BELLOCQ A , AZOULAY E , MARULLO S , ea al . Reactive oxygen and nitrogen intermediates increase transforming growth factor-beta1 release from human epithelial alveolar cells through two different mechanismsJ . Am J Re