ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记的实验原理及操作流程.doc

ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记的实验原理及操作流程ISSR（inter-simplesequencerepeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3或5锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。关键词：标记分子ISSRinter-simplesequencerepeatSSR引物RAPD分子标记单寡聚核酸ISSR标记 ISSR（inter-simplesequencerepeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在 3或5锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5或3末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。 一、实验材料 不同来源的 DNA(30-50ng/ul)。 二、实验设备 PCR仪，PCR管或硅化的 0.5mleppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。 三、试剂 1、 ISSR引物：购买成品或根据加拿大BritishColumbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。 2、Taq酶 3、10xPCR缓冲液 4、MgCl2：25mmol/L。 5、 dNTP：2.5mmol/L。四、操作步骤： 1. 在25ul反应体系中，加入 模板DNA 1ul (30-50ng) ISSR引物 1ul (约5pmol) 10xPCR Buffer 2.5ul MgCl2 2ul dNTP 2ul Taq酶 1单位（U） 加ddH2O 至 25ul 混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。 2. 在PCR仪中预变性94 2分钟, 然后循环: 94 1分钟， 45-68 40秒， 72 1-2分钟，共40轮循环。 3. 循环结束后, 72 10分钟，4保存。 4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6% 或1.8% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100（电压低带型整齐， 分辨率高）。 5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。 6. 用凝胶成像仪观察、拍照。 操作流程简图：注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等 DNA提取可采用CTAB或SDS法 DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite)引物名称序列引物名称序列801ATA TAT ATA TAT ATA TT851GTG TGT GTG TGT GTG TYG802ATA TAT ATA TAT ATA TG852TCT CTC TCT CTC TCT CRA803ATA TAT ATA TAT ATA TC853TCT CTC TCT CTC TCT CRT804TAT ATA TAT ATA TAT AA854TCT CTC TCT CTC TCT CRG805TAT ATA TAT ATA TAT AC855ACA CAC ACA CAC ACA CYT806TAT ATA TAT ATA TAT AG856ACA CAC ACA CAC ACA CYA807AGA GAG AGA GAG AGA GT857ACA CAC ACA CAC ACA CYG808AGA GAG AGA GAG AGA GC858TGT GTG TGT GTG TGT GRT809AGA GAG AGA GAG AGA GG859TGT GTG TGT GTG TGT GRC810GAG AGA GAG AGA GAG AT860TGT GTG TGT GTG TGT GRA811GAG AGA GAG AGA GAG AC861ACC ACC ACC ACC ACC ACC812GAG AGA GAG AGA GAG AA862AGC AGC AGC AGC AGC AGC813CTC TCT CTC TCT CTC TT863AGT AGT AGT AGT AGT AGT814CTC TCT CTC TCT CTC TA864ATG ATG ATG ATG ATG ATG815CTC TCT CTC TCT CTC TG865CCG CCG CCG CCG CCG CCG816CAC ACA CAC ACA CAC AT866CTC CTC CTC CTC CTC CTC817CAC ACA CAC ACA CAC AA867GGC GGC GGC GGC GGC GGC818CAC ACA CAC ACA CAC AG868GAA GAA GAA GAA GAA GAA819GTG TGT GTG TGT GTG TA869GTT GTT GTT GTT GTT GTT820GTG TGT GTG TGT GTG TC870TGC TGC TGC TGC TGC TGC821GTG TGT GTG TGT GTG TT871TAT TAT TAT TAT TAT TAT822TCT CTC TCT CTC TCT CA872GAT AGA TAG ATA GAT A823TCT CTC TCT CTC TCT CC873GAC AGA CAG ACA GAC A824TCT CTC TCT CTC TCT CG874CCC TCC CTC CCT CCC T825ACA CAC ACA CAC ACA CT875CTA GCT AGC TAG CTA G826ACA CAC ACA CAC ACA CC876GAT AGA TAG ACA GAC A827ACA CAC ACA CAC ACA CG877TGC ATG CAT GCA TGC A828TGT GTG TGT GTG TGT GA878GGA TGG ATG GAT GGA T829TGT GTG TGT GTG TGT GC879CTT CAC TTC ACT TCA830TGT GTG TGT GTG TGT GG880GGA GAG GAG AGG AGA831ATA TAT ATA TAT ATA TYA881GGG TGG GGT GGG GTG832ATA TAT ATA TAT ATA TYC882VBV ATA TAT ATA TAT AT833ATA TAT ATA TAT ATA TYG883BVB TAT ATA TAT ATA TA834AGA GAG AGA GAG AGA GYT884HBH AGA GAG AGA GAG AG835AGA GAG AGA GAG AGA GYC885BHB GAG AGA GAG AGA GA836AGA GAG AGA GAG AGA GYA886VDV CTC TCT CTC TCT CT837TAT ATA TAT ATA TAT ART887DVD TCT CTC TCT CTC TC838TAT ATA TAT ATA TAT ARC888BDB CAC ACA CAC ACA CA839TAT ATA TAT ATA TAT ARG889DBD ACA CAC ACA CAC AC840GAG AGA GAG AGA GAG AYT890VHV GTG TGT GTG TGT GT841GAG AGA GAG AGA GAG AYC891HVH TGT GTG TGT GTG TG842GAG AGA GAG AGA GAG AYG892TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCC C843CTC TCT CTC TCT CTC TRA893NNN NNN NNN NNN NNN844CTC TCT CTC TCT CTC TRC894TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN845CTC TCT CTC TCT CTC TRG895AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC846CAC ACA CAC ACA CAC ART896AGG TCG CGG CCG CNN NNN NAT G847CAC ACA CAC ACA CAC ARC897CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G848CAC ACA CAC ACA CAC AR