鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数.doc

血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100g/ml。血清为临时添加，终浓度为20%。巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000g/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。使用时每1ml加10L即100g/mL。剩余-4冻存。鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO47H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100L。胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10%MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4保存。使用时用PBS稀释至0.4%。1.2器材离心机1、15、50ml离心管 1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。试剂为肝素钠抗凝剂、DMEM培养基、血清、双抗（自配10,000ug/ml）、0.01%高锰酸钾、丁香酚（丁香酚：无水乙醇=1：1）2.1.1麻醉取血 鱼体用 0. 01%高锰酸钾溶液浸泡消毒0. 5 h，滴入适量麻醉剂使其麻醉，取出喷75%酒精以无菌纱布擦拭体表，移至超净台内，以5mL注射器吸取0.1mL肝素钠抗凝剂，而后垂直由腹端插入臀鳍腋下直至血管进行取血。每尾取血2ml左右，装于无菌2ml EP管中。加入20ul甘油或DMSO，血液冻存于-4冰箱。2.1.2 细胞培养采用0.01mM 2-巯基乙醇作为培养基添加因子，另外加入20%FBS。染色须用30mm培养皿+入盖玻片，每个1.5ml培养基+60ul血液，共设置4组，每组3个进行Wright- Giemsa染色，观察细胞形态进行细胞分类的鉴定。剩余2组进行台盼蓝染色，测定细胞存活率。（此步盖玻片须用强酸泡洗）MTT采用2个96孔板，每孔100ul，细胞浓度理论上为104-105/ml.设置：置0组，对照组，LPS组，ConA组，PHA组终浓度均为0.3mg/ml。另外采用培养瓶培养每组3个共12个，以备实验用。0.4ml血液+10ml培养基。每瓶加入3ml培养基，随后加入35ul双抗，0.75ml血清。培养瓶装入餐盒后置于烘箱内室温培养。0.3mg/ml的PHA和0.3mg/ml的ConA做刺激源，0.1mM的2-巯基乙醇接种时另取一EP管，加入2ml PBS，80ul血液，细胞计数。2.1.3细胞检测：染色检测（Wright与Giemsa染色）可检测细胞类型；MTT检测、细胞计数检测可检测细胞增殖2.1.3.1Wright- Giemsa混合染色取两样各0.5g，甲醇500ml，配成混合染液，将盖玻片浸入95%酒精固定15min，PBS洗两次，每次1min，盖玻片浸入含染液的培养皿中，静置1min，取出浸入染色液与ddH2O按1:2体积的培养皿中，静置15min，自来水冲洗经70%、80%、90%酒精各一次，95%2次，100%3次，每次1min二甲苯透明3次，每次1min，低价中性树胶，封片2.1.3.2 MTT检测1: 收集血细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2: 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间。在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。2.1.3.3细胞计数1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)2104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3。3结果细胞玻片混合染色那一步经固定染色封片以后可以进行形态学观察以及鉴定。另外可以进行光镜100倍随机视野下的统计细胞数，进行一些统计学的分析。MTT那一步结果会得到一些吸收值，进而进行分析。2.1.3.4传代测贴壁率倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化，加入3ml培养基，采用2个培养瓶 Giemsa染色步骤：Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。其主要用Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。Giemsa染色的基本材料为：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56保温2小时后，加入33mL纯甲醇，保存于棕色瓶内。染色的基本步骤为：（1）准备染液：用pH6.817.38的Sorensen缓冲液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液；Sorensen缓冲液的配制：pH6.81：Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL;pH6.98：Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mLpH7.17：Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL；pH7.38：Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。(2)细胞标本用甲醇固定10分钟，或用1:3醋酸/甲醇固定30分钟，用滴管把染色液布满玻片上，注意不要有气泡，用染色缸染色亦可，染1015分钟；(3)用自来水冲去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。Giemsa染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞浆成粉红色Wright瑞士染色一般用于血液涂片，也可用于检查肿瘤细胞。1、试剂配制瑞士染液：（由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成） 瑞士染料 1g 甲醇 600ml将瑞士染料放入研钵内，加入适量甲醇与之混合研磨，使染料逐渐溶解。将溶解的染液倾入另一玻璃瓶内，然后再加入适量甲醇继续研磨；未溶解的染料如此反复多次，直至染料完全溶解、甲醇用完为止。染液避光保存备用。磷酸盐缓冲液： 无水磷酸氢二钠 6.5g 磷酸二氢钠 4g 蒸馏水 1000ml PH：6.57.02、染色程序涂片自然干燥。滴加瑞士液染色1min。滴加等量的磷酸缓冲液，轻轻摇荡玻片或洗耳胶球在玻片上轻轻吹气，使两液体混合均匀，持续1015min。流水洗去染液。涂片风干后，二甲苯透明，中性树胶封片。注意事项1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。 2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以医.学教.育网整.防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。 3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。 4）瑞氏染色液由瑞氏染料、甲醇（AR级以上）和甘油组成，液为磷酸盐缓冲液（pH6.4pH6.8）。细胞计数具体操作：实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。一、准备工作：取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。二、细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。三、细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)2104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3。四、细胞计数要点：1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。五、初学者易犯的错误：1.计数前未将待测悬液吹打均匀。2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。六、本实验特殊试剂的配制：4台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4即可。MTT染色MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2: 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用