CTAB法和磁珠法提取植物DNA的比较研究.doc

CTAB法和磁珠法提取植物DNA的比较研究 分子生物学教学实验方法改进探索韩 霜（ 洛阳师范学院 生命科学系 河南洛阳 471022 ）摘要:通过学生实验教学过程，比较研究了CTAB法和磁珠法提取DNA的优劣，得出磁珠法无论从DNA的提取质量、实验过程的安全性和提取时间等方面都大大优于传统的CTAB法。为磁珠法提取植物DNA实验在大、中、小学生的分子生物学、遗传学等实验课教学普及应用方面奠定了一定的基础，从而促进了生物实验教学方法的优化和改革。1 实验仪器、材料和试剂1.1 主要实验仪器与设备传统CTAB法：研钵、水浴锅、1.5ml离心管、高速离心机、移液枪、凝胶成像系统等磁珠法： 漩涡振荡器 磁力架 植物磁珠法DNA试剂盒等 1.2实验材料CTAB法: 新鲜菠菜叶片磁珠法：各种植物老叶嫩叶、根茎、种子等，可任选其一(本实验用菠菜叶片)。1.3 实验试剂CTAB法: CTAB溶液、CTAB溶液、氯仿异戊醇、异丙醇、70（V/V）乙醇、RNase(10mg/ml)、琼脂糖、50TAE、溴化乙啶母液磁珠法：细胞裂解液（Buffer A 、Buffer B）、磁珠结合液、洗涤液、洗脱液、电泳缓冲母液、电泳指示液、花箐类核酸染色液 2 实验步骤2.1 CTAB法2将300mg菠菜嫩叶加入研钵中快速研磨，研磨的尽量细。 将研磨好的材料加入1.5ml的离心管中，加400LCTAB,混匀。 加入500l 65预热的CTAB溶液，65保温30min,不时颠倒混匀。 冷至室温后加450l氯仿异戊醇（24:1），颠倒混匀使溶液呈乳浊状（不要振荡），以8000rmin的转速离心5min。 取上清液，加5l RNase，37保温30min。 加600l预冷的异丙醇，颠倒混匀。 以8000rmin的转速离心10min，沉淀DNA，弃去上清液。依次用800l 70（V/V）乙醇洗涤沉淀两次。 稍干燥，将DNA沉淀溶解于30l灭菌的双蒸水，4保存。 在0.7（m/V）的琼脂糖凝胶上稳压电泳，检测基因组DNA的情况。2.2 磁珠法提取DNA裂解:称取菠菜叶片50mg，撕成小片放入研钵中稍加研磨，加入400ul BufferA，混匀转移至1.5ml EP管中。然后把EP管置于恒温水箱中65温育15min。将EP管从温浴设备中取出，10000r离心5min。结合:从离心后的EP管中小心吸取上清200ul至新的1.5ml EP管，加入振荡混匀的磁珠结合液200ul，点振35次混匀，室温下放置5min后（如有分层现象，再稍振荡均匀），进行磁分离，用较细吸头吸弃废液，避免吸掉磁珠。洗涤:加入400ul洗涤液，轻轻点振混匀，放置10S，然后将EP管放在磁力架30S，进行磁分离，待磁珠吸至管壁后，吸弃废液，再加入400ul洗涤液，洗第二次，彻底吸净管盖及管底的残液，室温下开盖干燥3min。洗脱:加入100ul洗脱液，缓慢抽吸混匀，65水浴10min。每隔23min轻摇EP管几下混匀.然后磁分离，小心吸取上清液（即DNA溶液）转移至新的EP管中。DNA的鉴定:取10ulDNA溶液进行电泳，20min后在紫外观察仪上观察。观察提出的DNA条带。3 实验结果分析植物基因组DNA提取CTAB法磁珠法实验原理利用DNA、RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面的差异利用包被磁珠的磁性和特异吸附核酸的性质一般步骤步骤繁琐裂解、结合、洗涤、洗脱检材用量300mg50mg所需时间3-4小时46分钟琼脂糖电泳检测结果点样孔滞留较多；DNA条带清晰，但拖尾现象严重；点样孔无或很少有滞留；DNA条带清晰，无拖尾现象；紫外分光光度计检测结果OD260/280在1.7以下；提取DNA的总量为5.0ug左右OD260/280在1.7-1.9之间；提取DNA的总量2.0ug左右；提取得率是前者的2.4倍方法评价1步骤繁琐，耗材多，耗时长，效率低，有违低碳环保理念简单快速，灵敏度高，耗材少，安全无毒，节能环保，效率高，符合高水准高效率的现代化教育和可持续发展理念，具有时代性和先进性。2提取的DNA杂质多，降解严重，不利于进行后续实验操作提取的DNA纯度高，DNA片段完整，可直接用于后续PCR扩增，保证教材前后实验的连续性。3操作难度大，学生兴趣不高 易于操作，极大地提高了学生对生物实验的兴趣。3.1 两种方法使用范围比较 CTAB法是提取植物基因组DNA的较有效的方法，因为植物细胞内多糖、多酚类物质含量较高不宜去除，而CTAB为强力去垢剂，对于去除多糖类杂质及蛋白污染具有良好的效果，然而对于衰老植物器官和高温烹制等处理过的植物却不宜使用此方法。磁珠法使用范围较广，除了适合于一般植物材料，对于这些传统方法难以提取的植物DNA来说也是一种适合且高效的提取方法。随着生物技术的不断发展，拥有快速、经济、安全、高效的的提取动物、植物基因组的方法将成为很多生物体内大分子及其运用规律研究者希望，若将磁珠法应用于如辣椒、人体螨虫、蚜虫等被热门研究的动植物基因组提取中，将会成为细胞生物学快速发展插上腾飞的翅膀。3.2 提取DNA质量结果比较以上两种方法提取的DNA悬液进行电泳后电泳结果如图所示： 菠菜叶基因组DNA琼脂电泳图1-8：磁珠法提取的DNA；M：标准分子量；9-16：CTAB法提取的DNA由实验结果比较可以得：磁珠法提取的DNA纯度高，片段完整且杂质较少，而普通方法提取的DNA，杂质多，DNA易降解，高分子量DNA含量很少，由此可见，磁珠法提取的DNA质量比传统方法大大提高，提取时间明显缩短。3.3安全性比较传统CTAB法的实验原理是利用DNA、RNA、蛋白质等在物理和化学方面的差异，运用一些试剂和方法，使DNA脱离细胞核，暴露在溶液中，利用氯仿把蛋白质、色素、脂肪等物质除去，获得较纯的DNA。其中最常用酚、氯仿等都是有毒或强腐蚀性试剂，对中小学生实验存在安全隐患，而磁珠法不涉及有毒有害试剂，操作快捷安全，有利于中小学生开展DNA提取实验。磁珠法提取DNA的原理主要是：磁珠是一种包被有生物活性集团的功能化载体，它拥有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点，因此它可以特异的吸附DNA，再通过洗涤去除杂质得到较纯净的DNA提取液。本次实验在课堂中的实际操作结果得出：大多数用磁珠法操作的学生都能简单快速的提取出高质量的DNA，而利用传统方法提取DNA的学生提取效果较差，且后者还要接触到有毒有害的化学药品，存在安全隐患,例如氯仿等有毒试剂操作不慎,将造成不可挽回的后果。由此可见，磁珠法相对于传统方法提取DNA，在中小学实验课中具有更强的优势。鉴于考虑到实验课堂的安全性，建议选择磁珠法进行提取DNA实验，从而使DNA提取实验可以更广的在中小学生中普及。3.4 实验时间比较 CTAB法提取DNA时，由于实验原理的限制，无法一次将DNA提取出来，过程冗繁且操作不易成功。磁珠法由于技术的优势，只需要进行简单的裂解，结合、洗涤、洗脱等步骤，即可得到DNA的提取液，成功率较高。除上述列举的几点之外，磁珠法还有灵敏度高、耗能少等特点，正符合当今节能环保的理念，同时也响应了高效率、大兴趣的现代化教育和可持续发展观点。由此可得：磁珠法能在较短时间内，高效率的提取到纯度较大的DNA，对于实验教学而言有着十分重要的意义。4 结语兴趣是最好的老师。众多的教学经验表明：学生怀着浓厚的兴趣去学习，能够深入挖掘他们本身的创造能力同时培养他们的对于未知世界的探索精神，最后在潜移默化中加强了他们自己的学习自觉性。磁珠法把物理学有关知识运用到生物学试验中的举措，可让学生明白很多学科都是相通的道理，进而激发学生学习的积极性，为以后的学习打下良好的基础。“教材中的某些实验如DNA的提取，由于实验步骤过于繁琐，导致实验持续过长而无法及时完成，严重影响实验教学效果和学生的学习兴趣，给学科教学带来一定的负面影响。”