近红外光谱法在药物分析中的应用.doc

近红外光谱法在药物分析中的应用冯艳春 胡昌勤（中国药品生物制品检定所 北京 100050） 近红外（Near Infrared，NIR）光谱的波长范围是7802526nm（128203959cm-1），通常又将此波长范围划分为近红外短波区（7801100nm）和近红外长波区（11002526nm）。由于该区域主要是O-H，N-H，C-H，S-H等含氢基团振动光谱的倍频及合频吸收，谱带宽，重叠较严重，而且吸收信号弱，信息解析复杂，所以虽然该谱区发现较早，但分析价值一直未能得到足够的重视。近年来，由于巨型计算机与化学统计学软件的发展，特别是化学计量学的深入研究和广泛应用，使其成为发展最快、最引人注目的光谱技术1。而且由于该技术方便快速，无需对样品进行预处理，适用于在线分析等特点，在药物分析领域中正不断得到重视与应用。1近红外光谱的测量根据NIR光谱的获得方式，通常有透射(Transmittance)和漫反射(DiffuseReflectance)两种2。透射测定法的定量关系遵从Lambert-Beer定律，主要适用于液体样品，其正常的工作波长范围是8501050nm3。浙江大学的史月华等人用该原理，在93%97.4%的浓度范围内利用维生素E在60615246cm-1处的近红外吸收峰面积积分值和其浓度关系建立回归方程，对已知浓度的样品进行预测，误差及相对误差均在0.79%0.9%内4，5。漫反射测定法是对固体样品进行近红外测定常用的方法。当光源垂直于样品的表面，有一部分漫反射光会向各个方向散射，将检测器放在与垂直光成45o角的位置测定散射光强的方法称为漫反射法。漫反射光强度A与反射率R的关系为式中，R1为反射光强，R0为完全不吸收的表面反射光强。国内已有人先后用漫反射技术测定了精氨酸阿司匹林6 、安乃近7 、芦丁和维生素E8 等的含量，并且用反射光谱法对磺胺噻唑9进行质量评价。 以透射和漫反射为测试基础，为适应不同物质在不同状态时直接测定其近红外光谱，90年代以来光纤技术在NIR中得到了广泛应用。光纤不仅可方便的传输光谱信号，各式各样的光纤探头还极大地方便了NIR进行各类快速在线分析。2近红外光谱技术在药物分析中的应用2.1应用范围近红外光谱法在药物分析领域中的应用范围相当广泛，它不仅适用于药物的多种不同状态如原料10、完整的片剂、胶囊与液体等制剂11，还可用于不同类型的药品，如蛋白质12、中草药13、抗生素14 等药物的分析。NIR更适用于对原料药纯度、包装材料等的分析与检测以及生产工艺的监控15，16 ；利用不同的光纤探头可实现生产工艺的在线连续分析监控17，18，19，20，21 。2.2定性、定量分析现代近红外光谱技术不是通过观察供试品谱图特征或测量供试品谱图参数直接进行定性或定量分析，而是首先通过测定样品校正集的光谱、组成或性质数据（组成或性质数据需通过其它认可的标准方法测定），采用合适的化学计量学方法建立校正模型，再通过建立的校正模型与未知样品进行比较，实现定性或定量分析。2.2.1定性分析近红外光谱谱带较宽，特征性不强，因此很少像其它光谱（如紫外光谱和红外光谱）那样用于化合物基团的识别及结构的鉴定。近红外光谱的定性分析一般是用于确定分析样品在已知样品集中的位置22。常用的方法包括:（1）判别分析法：判别分析是经典的定性识别方法，其基本思路是相同样品在不同波长下具有相近的光谱吸收，这种光谱间的比较可以是原始光谱，也可以是经过处理的光谱。（2）主成分分析（Principal Component Analysis PCA）法：利用PCA方法将多波长下的光谱数据压缩到有限的几个因子空间内，再通过样品在各因子空间的得分确定其归属类别，但PCA对样本与校正集间的确切位置缺乏定量的解释。任玉林等采用此方法研究了去痛片23的近红外漫反射光谱，总结出对标化后的数据进行主成分分析可减小颗粒大小的变化所产生的散射影响，并且用第二主成分得分对第一主成分作图可以将合格样品与不合格样品区分开来。其缺点是当真药与劣药的含量相当接近时此法容易分错24。（3）马氏距离（Mahalanobis Distance MD）法：该方法的核心是通过多波长下的光谱距离定量描述出测量样本离校正集样本的位置，因而在光谱匹配异常点检测和模型外推方面都很有用。但应用该方法时，波长位置的选择非常重要，波长点过少，光谱得不到合理的描述；波长点过多，计算量大，为此，徐广通提出将PCA与马氏距离相结合解决模型的适用性判断，可以充分利用PCA对大量光谱数据进行降维处理，也较好地解决了马氏距离计算时波长点的选择问题，避免了大量光谱数据直接进行马氏距离计算出现的共线性或计算量大等问题，且克服了采用PCA自身进行判断界限不易量化的问题25。2.2.2定量分析近红外光谱测量时一般不需对样品进行预处理，但测定的光谱可能受到各种干扰因素的影响。利用单一波长下获得的光谱数据很难获得准确的定量分析结果。NIR光谱结构复杂，谱图重叠较多，所以在进行定量分析时，一般采用多波长下获得的数据并进行一定的数据处理才能获得准确可靠的分析结果。常用方法如下：（1）主成分回归（Principal Component Regression， PCR）：原理与PCA相同。吉林大学的任玉林等在此方面进行了深入研究26。PCR在解释光谱数据时起着重要作用，从主成分权重图中能够确定主成分与哪个组份有关，但确切而全面地解释每个主成分代表什么迄今仍是最难解决的问题。（2）偏最小二乘法（Partial Least Square PLS）：该法是一种全光谱分析方法，充分利用多个波长下的有用信息，无需刻意的选择波长，并能滤去原始数据噪音，提高信噪比，解决交互影响的非线性问题，很合适在NIR中使用27。实验证明，PLS法同近红外漫反射光谱法结合，直接分析固态粉末药品磺胺甲基异唑28、安体舒通29、安乃近30、磺胺脒31是可行的，同其它方法相比具有速度快、简便、且不破坏样品的优点。（3）人工神经网络法（Artificial Neural Networks ANN）：近年来兴起的ANN法研究，根据样品各组分的光谱数据建立人工神经网络模型，预测未知样品并讨论影响网络的各参数。采用ANN法对阿司匹林32、扑热息痛33、美的康34等药物定量分析的结果表明，ANN法的最大优点是其抗干扰、抗噪音及强大的非线性转换能力，对于某些特殊情况ANN会得到更小的校正误差和预测误差，并且它的预示结果要稍优于PLS（t检验无显著差异）。这可能是由于ANN法具有更强的非线性处理能力所致。此外还有多元线性回归（Multiple Linear Regression MLR）、拓扑（Topology TP）等方法也在近红外光谱分析中得到应用。3问题与展望尽管N I R在药物分析领域显现出勃勃生机，但目前它还存在一定的弱点。首先，它是一种间接的相对分析技术，通过收集大量具有代表性的标准样品，通过严格细致的化学分析测出必要的数据，再通过计算机建立数学模型，预测未知样品的结果。而模型的建立需耗用大量的人力、物力和财力；其次，由于NIR谱区为分子倍频与合频的振动光谱，信号弱，谱峰重叠严重，所以目前还仅能用于常量分析，被测定组分的量一般应大于样品重量的0.1%；此外，在进行近红外光谱分析时，应考虑样品的特征、分析实验的设计及数据处理等多方面的问题，才能取得正确的分析结果，建立可靠的校正模型是近红外光谱成功的关键，而合理的实验设计和恰当的分析模型则是建立校正模型的关键35。NIR光谱分析的最大特点是操作简便、快速，可不破坏样品进行原位、在线测量；测量信号又可以远距离传输和分析；特别是与计算机技术和光导纤维技术相结合，采用NIR透射、散射、漫反射光谱学检测方法，可以不使用化学试剂，不必进行预处理，可直接对颗粒状、固体状、糊状、不透明的样品进行分析。这些特点正逐渐被制药界所认识，并显示出极大潜力，在制药工作和质量控制分析中具有广阔的应用前景。此外，NIR用于生产过程中的含量与水分分析也表现出独特的魅力36。目前NIR已成为AOAC(Association of Official Analytical Chemists)一种标准分析方法应用于药品检测中37。仪器生产商和药物分析专家的合作开发已使FDA、欧洲和加拿大药物管理局正式研究用近红外光谱分析技术取代繁琐费时的常规分析方法的可行性，部分测试项目已被FDA批准为标准方法。USP(United States Pharmacopia第25版)最近已在附录中增补近红外分析方法38。国内，在SDA（State Drug Administration）的支持下，我所正在探索药品监督检验执法过程中采用NIR进行快速鉴别及定量分析的可行性。结合全国抽验工作， 对NIR模型的准确性及模型传递的误差进行系统评价，这项工作的开展对打击假劣药品具有重要意义。参考文献1 史永刚,等. 化学计量学在近红外光谱定性分析中的应用.光谱实验室,1999,16(3):2372 汪尔康主编.21世纪的分析化学. 北京:科学出版社,2001:783 徐坤,等.近红外光谱分析技术及应用. 莱阳农学院学报,2001,18(3):2374 史月华,等.近红外光谱法定量分析维生素E .分析化学研究简报,2000,28(5):5875 冯海,等.近红外光谱法同时测定多种雌、孕激素.分析化学研究简报,2001,29(2): 1756 乔梁,等.应用近红外漫反射技术测定精氨酸阿司匹林的含量.药物分析杂志,1998,18(5):2977 任玉林,等.近红外反射光谱法评价安乃近药物质量.光谱学与光谱分析,1997,17(3): 518 杜德国,等.芦丁和维生素C的近红外漫反射光谱技术定量分析研究.光谱学与光谱分析,2000,20(4):4749 任玉林,等.近红外漫反射光谱法和多变量统计分类技术用于磺胺噻唑质量评价的研究.分析仪器,1998,1:4310 汤真,等.粉末药品安体舒通的无损定量分析人工神经网络近红外光谱法的应用. 分析测试学报,2001,20(3):6211 任玉林,等.近红外反射光谱法对液态样品的非破坏分析.光谱学与光谱分析,1997,17(1):5012 曹静懿译.非破坏检测法-近红外分光法的运用.中成药,1995,17(12):5113 刘国林,等.近红外光谱技术在元胡止痛散定量分析中的初步应用研究.中国现代应用药 学杂志,2000,17(5):38314 Plugge w.，et al.The use of near infrared spectroscopy in the quality control laboratory of the pharmaceutical industry. 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