Oasis HLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2.doc

Oasis HLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 劳 哲，江恩源，（梧州市疾病预防控制中心 广西梧州 543002）摘要：目的建立了Oasis HLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法。方法样品用甲醇-水（V:V=20:80）提取，离心后过Oasis HLB柱萃取净化，超快速液相进行梯度洗脱，质谱用电喷雾离子源（ESI）,经过正离子MRM模式，外标法定量。结果黄曲霉毒素(AFT) B1、B2、G1、G2的最低检出限分别为：0.05、0.05、0.10、0.20g/kg，平均加标回收率在89.3%98.7%之间，精密度（RSD）在2.6%5.3%之间。结论本法利用Oasis HLB固相萃取柱良好的性能和质谱仪采用弯曲180度的碰撞池技术大大减少了样品中的杂质干扰，精密度和准确度高，方法操作简便，结果可靠。关键词：超快速液相；三重四极杆质谱；Oasis HLB固相萃取；黄曲霉毒素Determination of Aflatoxin B1, B2, G1, G2 in Peanut and Peanut Oil by Oasis HLB SPE- Ultra Fast Liquid Chromatography-TripleQuadrupoleTandem Mass Spectrometry LAO Zhe，JIANG En-yuan (Center for Disease Control and Prevention of Wu Zhou，Guangxi Wuzhou，543002)ABSTRACT: Objective A method for Determination of aflatoxin B1, B2, G1, G2 in pe-anut and peanut oil by oasis HLB SPE-high performance liquid chromatography-triplequa-drupoletandem mass was established.Methods The sample undergoes methanol-water (V:V=20:80) extraction, extraction purification through Oasis HLB Cartridge after centrifugat-ion. Gradient elution of liquid chromatography, ESI is applied as mass spectrum, which is subject to positive ion MRM mode and quantitation with external standard method. The minimum detection limit for AFT B1, B2, G1 and G2 are respectively:0.05,0.05,0.10 and 0.20ng/mL.Results the average recovery rate of standard addition is 89.3%98.7%, RSD is 2.6%5.3%. Conclusions By optimizing sample extraction conditions, precision extra-ction of Oasis HLB SPE and collision cell with a 180 degree are adopted to greatly redu-ce the impurity interference in the sample, and increase precision and accuracy. It can ob-tain reliable results with simple operation.KEY WORDS: ultra fast liquid chromatography; triple quadrupole tandem mass spectrometry; Oasis HLB solid phase extraction; aflatoxin 黄曲霉毒素(AFT)是食物及饲料中寄生的黄曲霉、寄生曲霉代谢的化学结构类似的一组产物，在潮湿温热地区出机率最高。它含有双呋喃环和氧杂萘邻酮，双呋喃环为基本毒性结构，氧杂萘邻酮与致癌性有关。接触浓度高时可导致肝癌甚至死亡。目前，测定食品中AFT的方法有酶联免疫法1、薄层层析法2、微柱筛选法3、免疫层析法4、金标试纸法5、免疫亲和柱净化液相色谱法6、液相色谱-质谱法7等。国家标准GB/T 5009.24-2011中推荐的检测方法是的薄层色谱法和微柱筛选法8。酶联免疫法操作的人为误差较大,主要应用于样品筛选和定性分析。薄层层析法和免疫层析法需要人工制作层析板，要手动进行点板和有机溶剂展开，操作过程复杂，重现性差。金标试纸法只适合快速定性测定，定量准确度差。微柱筛选法所需的微柱层析管必须要随装随用，柱管很容易在空气中吸水导致活性下降影响吸附率，使检测结果不够稳定。免疫亲和柱净化液相色谱法由于免疫亲和柱受温度影响大，太高或太低的温度都会对亲和柱的回收率有一定的影响，而且价格较高，不适合基层单位进行大批量分析样品。Oasis HLB 吸附剂是由亲脂性二乙烯苯与亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成大孔共聚物。保留机理为反相，通过特殊的极性捕获基团（极性钩）增加对极性物质的保留提供良好的水浸润性。可用于中性、碱性和酸性化合物的通用型吸附剂，回收率高而稳定9。根据资料分析，Oasis HLB固相萃取柱使用分析效果较好，价格比免疫亲和固相萃取柱便宜很多，更适合大批量检测。本文采用Oasis HLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。 1材料与方法1.1仪器与试剂AB SCIEX TripleQuad-3500质谱仪（带ESI离子源）；Shimadzu Nexera XR超快速液相色谱仪；Waters Oasis HLB固相萃取柱（3cc，60mg）；全自动固相萃取仪（上海屹尧EXTRA）； Vortex-Genie2涡旋振荡器；Cence-H1850高速离心机；力德LAA-10-L超纯水机；氮吹浓缩仪（上海屹尧N1）；0.22m、0.45m滤膜+抽滤头（有机相）；乙腈（TEDIA色谱纯）、甲醇、甲酸、正己烷（Merck色谱纯）；氯化钠（西陇化工优级纯）；IKA A11研磨机；黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（北京华安麦科生物技术有限公司）；黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准物质（农业部环境保护科研监测所SB05-195、196、197、198-2008）；黄曲霉毒素标准样品Level#AC-274；Level#AC-270（新加坡普瑞邦公司，Grade PRIBOLAB, aflatoxin in maize flour oekanal analytical standard）。 1.2提取准确称取5.00g研磨均匀的花生或花生油样品至50mL塑料离心管中，加入5mL正己烷、5mL超纯水、2g氯化钠充分震荡均匀后加入10mL甲醇-水（V:V=20:80）提取液，在涡旋振荡器高速震荡（300r/min）10min，以11000r/min离心5min，花生样品收集上清液（花生油样品用带针头的注射器收集下层清液）于50mL比色管中。残渣中再加入10mL提取液再提取一次，合并提取液用注射器吸取后推出通过抽滤头（0.45m滤膜），滤出的清液备用。1.3 净化过全自动固相萃取仪设定程序为：用10mL甲醇活化Oasis HLB固相萃取柱，6mL纯水平衡柱子；将收集的滤出的清液经上样：10.0mL，流速：1.0mL/min；淋洗：3.0mL的甲醇-水（5:95），流速：1mL/min；用2.0mL空气吹干；洗脱：5.0mL甲醇洗脱，流速：1.0mL /min；洗脱液于定量浓缩仪内用氮气吹至近干，用1.0mL乙腈溶解，用注射器吸取后推出通过抽滤头（0.22m滤膜），滤出液用乙腈定容至1.00待上机分析。1.4 液相色谱条件色谱柱：Shim-pack XR-ODS（75mm 2.0mm，2.2m）；流速：1.0mL/min；进样体积：10.0L；柱温： 30；流动相：A为水（0.2%甲酸）；B为乙腈；梯度洗脱程序：02min，20%B；25min，20%B95%B；59min，95%B；910min，95%B10%B；1012min，10%B。1.5 质谱条件电喷雾离子源正离子扫描（ESI）；多反应监测模式（MRM）；喷雾电压（IS）:5500V；气帘气压力（CUR）：20 psi；碰撞气压力（CAD）：8 psi；雾化温度（Temp）：600；雾化气压力（Gas1）：55 psi；辅助气压力（Gas2）：60 psi。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的质谱优化条件设置见表1。表1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的质谱优化条件设置化合物 母离子/m/z 子离子/m/z DP/V EP/V CE/V CXP/V AFT B1 313.1 285.1（目标） 100 10 33 15 241.0（参考） 100 10 50 15 AFT B2 315.0 259.0（目标） 100 10 40 15 287.0（参考） 100 10 36 15 AFT G1 329.0 243.0（目标） 110 10 36 15 200.1（参考） 110 10 56 15 AFT G2 331.1 313.1（目标） 95 10 35 15 245.1（参考） 95 10 42 15 备注： DP: 去簇电压；CE: 碰撞能；EP碰撞室入口电压；CXP：碰撞室出口电压。2结果2.1 检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2标准溶液得到MRM质谱图按照表1的质谱优化条件，以多反应监测模式（MRM）检测5g/L的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2混合标准溶液得到MRM质谱图见图1。图1 5g/L的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2混合标准溶液MRM质谱图多反应监测模式（MRM）的工作原理是先检测具有特异性的母离子，然后只将选定的特异母离子进行诱导碰撞，去除其他子离子干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号采集。以目标离子对和参考离子对的保留时间和特异的离子质谱响应信号进行定性，以目标离子对的峰面积进行定量。黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的目标离子对的保留时间分别是：2.55min；2.47 min；2.45 min；2.37 min。2.2 检测样品待测液得到MRM质谱图 按照照表1的质谱优化条件，以多反应监测模式（MRM）检测花生样品待测液得到MRM质谱图见图2。图2 花生样品的MRM质谱图以花生样品中的黄曲霉毒素 B1、B2的目标离子对的峰面积与标准系列的目标离子对的峰面积进行回归分析定量。2.3 线性范围和检出限制备和花生基质相似的不同浓度的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液，用目标离子对的峰面积y和对应的浓度x（g/L）做图，绘制标准曲线，各组分均呈良好线性关系，相关系数在0.99910.9996之间,。以3倍的信噪比所对应的浓度作为检出限，经计算得出黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的检出限分别为：0.02、0.02、0.03、0.06 g /kg。以10倍的信噪比（S/N）计算定量下限，分别为：0.05、0.05、0.10、0.20g/ kg，均满足检测要求。回归方程和线性范围见表2。表2 回归方程和线性范围化合物 回归方程 相关系数 线性测定范围 检出限 定量下限/R /g/ kg /g/ kg /g/ kgAFT B1 y=6.15103x+31 0.9996 0.0520 0.02 0.05AFT B2 y=1.57103x+129 0.9994 0.0520 0.02 0.05AFT G1 y=3.07103x+28 0.9991 0.1030 0.03 0.10AFT G2 y=5.27103x+246 0.9995 0.2040 0.06 0.202.4 方法精密度和回收率分别称取空白样品各5.00 g，分别添加AFTB1、B2、G1、G2标准溶液，使4组分浓度均为1.0，5.0和 l0.0g/kg，不同组分的每个浓度进行6个平行样分析，结果为：平均回收率在89.3%98.7%之间；RSD在2.6%5.3%之间，均满足检测要求。结果见表 3。表3 回收率和精密度添加水平/g/kg AFT 平均回收率/% RSD/%1.0 B1 91.6 4.3B2 89.6 4.1G1 90.1 5.3G2 91.6 3.95.0 B1 92.3 3.2B2 89.6 4.5G1 91.7 4.9G2 91.9 3.810.0 B1 93.7 3.4B2 98.7 2.6G1 95.7 2.9G2 89.3 3.32.5 同时检测黄曲霉毒素标准样品的质控结果 经过与样品同时检测黄曲霉毒素标准样品Level#AC-274；Level#AC-270（新加坡普瑞邦公司，Grade PRIBOLAB, aflatoxin in maize flour oekanal analytical standard）作为质控，质控结果测得值与标准含量值的偏差符合标准样品证书上的7.3（0.9）g/kg与17.7（2.3）g/kg的检测结果允许偏差要求，质控结果见表4。表4 质控结果标准样品编号 AFT B1含量 测得值 平均值 偏差 /g/kg /g/ kg /g/ kg /g/kgLevel#AC-274 7.3（0.9） 6.89 6.73 7.1 6.86 -0.44Level#AC-270 17.7（2.3） 16.64 17.42 16.23 16.63 -1.073讨论固相萃取柱的选择，由于Oasis HLB固相萃取柱特殊的极性捕获基团（极性钩）的水浸润性，即使柱床意外干涸，也不影响回收率10。吸附容量高，与硅胶相比，Oasis HLB吸附剂的表面积增大2到3倍，大大提高了容量因子，与C18相比，30mg Oasis HLB的吸附容量，相当于100mg C18。本试验分别使用免疫亲和固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱进行加标回收试验。实验结果表明使用Oasis HLB固相萃取柱的平均回收率在89.3%98.7%之间，使用免疫亲和固相萃取柱的平均回收率在75.8%91.3%之间，使用Oasis HLB固相萃取柱的效果更好。提取方式与净化条件的优化，用乙醚和乙酸乙酯作为提取液时，操作步骤多，需要多做一步旋转蒸发，而用甲醇作为提取液时可以减少这步操作。取多份平行样分别用甲醇-水的比例为：10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30进行提取，结果为甲醇-水（V:V=20:80）作为提取液的样品检出的黄曲霉毒素的峰面积最高，证明20:80的比例是最佳比例。净化条件的优化，本文采用Oasis HLB固相萃取柱同时净化4种黄曲霉毒素。在淋洗的过程中试验了不同体积比的甲醇-水，结果显示：3mL的甲醇-水（V:V=5:95）淋洗，5mL甲醇洗脱得到的效果最好。液相色谱条件的优化，用乙腈-水作为流动相，质谱信号高，峰型对称。试验了在乙腈-水中加入甲酸有助于待测物母离子M+H的形成11，而且随着甲酸添加的量增加，质谱的信号值呈上升趋势，在达到1.5%甲酸时质谱的信号值最高，继续加大添加量信号反而降低。经过综合考虑。本文采用加0.2%甲酸的乙腈-水混合体系作为流动相。质谱条件的优化，根据4种黄曲霉毒素的结构特点,选择正离子模式电离,分别对质量浓度为1.0 ng/mL的4种黄曲霉毒素标准溶液进行一级质谱扫描,找到其准分子离子峰,然后分别优化其去簇电压（DP）。分别以其准分子离子作为母离子，通过碰撞气碰撞产生一些碎片离子进行二级质谱扫描，优化碰撞电压（CXP），选择丰度比较高的2种碎片离子为定性和定量特征离子12。通过试验优化，4种黄曲霉毒素的定性和定量特征离子及优化的质谱参数见表2。使用全自动固相萃仪的优势，本方法选用的全自动固相萃取仪的最大处理样品量多达108个，能够满足各种样品数量用户的需求。精准的吸液体积和灌注定位，精确控制液体流速，大大降低了实验工作中存在的误差。多通道的样品技术自动完成从活化、进样、到淋洗、洗脱的全部工作，节省了大量的人力，极大的缩短了检验时间。本文的建立了Oasis HLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法。此方法样品前处理简单、选择性好、灵敏度高，线性关系、重现性和回收率等指标较好，为测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2提供了一种准确、可靠的方法。参考文献1 黄思伟,张银菊,宋红,等. 荧光光度