Prion蛋白分子生物学机制研究进展.doc

Prion蛋白分子生物学机制研究进展刘卓宝,洪琪,何华松,丁瑾瑜(上海市疾病预防控制中心,上海200336)Prion蛋白(Prion Protein, PrP),又称朊病毒1、朊蛋白、朊毒体、锯蛋白、朊粒等。致病性Prion蛋白(PrPsc)是一种不含核酸却能不停复制和沉淀,而具传染性和极强抵抗力的特殊蛋白质粒子,在机体中沉积至一定程度,即可引起人和动物的传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy, TSE)。其主要的病理特点是:神经元变性、消解,形成脑实质多孔性泡化;星形胶质长纤维细胞增生,形成淀粉样斑块等。其发病机制至今尚未完全阐明。有唯蛋白质说、非寻常病毒说、拟病毒说、联合学说等。但大多学者赞同唯蛋白质说,并已被逐渐证实2。目前已知由Prion蛋白引起的人畜共患性传染病约有30余种3,统称Prion disease (朊病毒病,传染性蛋白病)。包括:人类朊病毒病:如,库鲁(kuru)病、克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease, CJD)、吉斯综合征(Gerstmann- Straussler syndrome,GSS)、致死性家族失眠症(fatal familia insomnia, FFI)等;动物朊病毒病:如,疯牛病(mad cow disease, MCD)、绵羊瘙痒症(scrapie of sheep)、山羊瘙痒症(scrapie of goats)、传染性水貂脑病(transmissible mink encephalopathy, TME)、糜鹿慢性消瘦病(chronic wasting disease, CWD)、猫海绵脑病(feline spongiformencephalopathy, FSE)等。下面仅就其共同病原朊蛋白的有关分子生物学机制问题,在近年的研究情况作一综述。1Prion蛋白的发现1732年,英国牧羊人发现一种可致绵羊死亡的羊瘙痒病(scrapie,亦称羊痒病)4。19201921年,德国两位神经病理学家Creutzfeldt和Jacob首先系统描述并报道了1名22岁妇女和6例中年人发生早老痴呆的中枢神经系统变性病,死者脑组织呈弥漫性神经元变性。后该病被命名为CJD(克雅病),现波及世界50多个国家,病例已超过2 200人,每年发病率约为1/百万5。1939年,英国Cuille与Chelle医生对患羊痒病的山羊脑研究后证实6,传染因子存在于可通过100nm孔径的细菌滤器的脑组织液中,具“类病毒”特征。1957年,美国国立卫生研究院(NIH)的病毒学家Gajdusek与Gibbs医生率领一支科学家小分队在大洋洲的新几内亚高原上,发现当时有食尸习俗的土著部族中流行一种震颤病(土语“kuru”,译音“库鲁”病),死者脑组织呈海绵状变性。在1962、1968年,两人分别将kuru病和CJD死者的脑组织滤液,接种于猩猩及猴均获得成功,动物染病且病原传代,从而证实羊痒病、kuru病、CJD可能为同一病原7。1976年, Gajdusek博士因此而荣获诺贝尔医学奖,他称kuru病病原为“不寻常的病毒”。1980年,美国加州大学旧金山分校一位神经学青年教授Prusiner,在潜心研究8年后,终于从患有羊痒病的羊脑中提纯出可使接种小鼠全部发病的感染因子,并确认该因子是不含核酸却能不停复制而具传染性的奇特蛋白质粒子,他将该致病因子命名为“Prion”(取“Protein”与“infection”两词首尾几个字母),称这种蛋白质为“Prion Protain”,简称“PrP”8。这一反传统的发现,被后来的多次其他实验证实。1997年,Prusiner因而荣获诺贝尔医学生理学奖。1985年底,英国兽医发现2 000头牛染上“疯牛病”(MCD),病牛脑组织呈海绵状变性。在尔后10多年间,MCD席卷31个国家3,除英国外,还有爱尔兰、瑞士、法国、比利时、卢森堡、荷兰、德国、葡萄牙、意大利、西班牙、列支敦士登、阿曼、日本、斯洛伐克、芬兰、奥地利等。1995后,英国又发现40余例新型变异性(Variability)克雅病(vCJD)。2000年10月26日,英国政府发表牛TSE调查报告,确认MCD可传染给人9,所谓新克雅病vCJD就是“人疯牛病”。从而引起全世界更多学者对Prion蛋白(PrP)的更强烈关注。2Prion蛋白的分子学特性后来的研究表明,“PrP”实际上有良性、恶性之分。Prusiner发现的可传染致病的PrP称PrPsc(sc取自“scrapie”的前2个字母)10。另一类则是后来发现,在人体内神经元等细胞膜表面也存在着的一种生理性PrP,其原始一级结构、相对分子质量均与PrPSC完全相同11,为示区别,特命名为PrPC(c取“cell”首字母)。现已大体搞清两者分子学特性的异同。2.1两类PrP的相同分子学特性在mRNA水平的氨基酸(AA)序列及分子量一致:有约253254个AA组成,为疏水性蛋白,其N端22个AA为信号肽,第2395处有一段富含甘氨酸和Cu2+等的5个8肽重复区,第96112氨酸为转录控制区12,13,113136 AA为跨膜区(复制关键区14、15),在179214处组氨酸残基间有1个二硫键连结。第136231 AA间有3个螺旋区。在C端第232AA残基可连结一个糖基磷脂酰肌醇锚(glycosyl phosphatidyl i-nositol, GPI),插入胞膜10。PrP有多种同种体(isoform),不同动物种族或同一动物体内不同组织的PrP表型也不尽相同,动物种属越接近,其PrP表型越近似,越易相互传染。一般来说PrPc只能变成同一类表型的PrPsc,但众多实验与研究证实这种种属屏障并不可靠。不被紫外线及r射线辐照破坏,但却可被胰蛋白酶降解。可被蛋白变性剂及AA化学修饰剂灭活或抑制。2.2两类PrP不同的分子学特性(表1)3PrPC的细胞生物学代谢PRNP基因表达,在核糖体内合成;随即转运到内质网,开始加工折叠;沿细胞分泌途径,再运至高尔基体,发生N-糖基化修饰(即C端切除21个AA残基后与GPI锚及甘露醇聚糖联接);再由胞内分泌小囊泡,分泌到胞膜表面,依靠GPI锚及脂肪酸、唾液酸等固定于细胞膜上(所在膜区多富含胆固醇、磷脂和糖脂);在胞膜表面可很快与小窝蛋白(Cave-olin)20等特定蛋白结合,并通过细胞吞饮作用回至自身或其他细胞内;在胞内可被降解或重新再运到胞膜上,也可被转化为PrPSC。表1 PrPc与PrPsc不同的分子学特性项目PrPcPrPsc属性良性,细胞表面的生理性糖蛋白恶性,致病性传染因子来源1220号染色体短臂PRNP基因表达外来传染或PRNP基因突变(如CJD、GSS、FFI)高级构象16,17螺旋占40%,折叠占3%螺旋占3%,折叠占43%蛋白酶K作用18,19敏感(又称PrPsen),可完全消解抵抗(又称PrPres),仅部分消解(N端)温和清洁剂中全溶,呈单体(PrP*)或二聚体、三聚体不溶,呈短杆状多聚体或羊痒病相关纤维(scrapie associatel fibrils,SAF)近年研究还证实,PrPc在人神经系统表达量最高21,在外周淋巴细胞、单核细胞、造血细胞也均有较高水平表达22、23,在心脏、骨骼肌、脾、胰、肾等组织中也可检测到24。在脑内,则以皮层、海马、纹状体和嗅球最为丰富,其次为中脑、丘脑和小脑,再次为脑干。在脑组织中广泛分布有PrPc的受体,后者为与IgG的Fc段结合的Prion蛋白(PrP Fc)21。4PrPc的生物学功能PrPc的生理功能至今尚未完全阐明。已知的有:PrPc是将Cu2+等从胞外运入胞内的跨膜转运载体蛋白25。一般认为N端的8肽重复区是Cu2+的结合部位。但也有报道PrPc的C端也可以结合Cu2+ 26。不同pH条件下,结合能力不同。Cu2+是SOD组成部分,故PrPc可保护神经元免遭过氧化攻击27。PrPc可调节神经细胞内钙离子浓度,而参与其信号传导28。有抑制脑内r-氨基丁酸(GABA)受体兴奋作用,缺如可致震颤。维持小脑皮层蒲肯野细胞活性,使机体不出现共济失调和早熟死亡。促进T淋巴细胞成熟、活化过程,可能与其C端的GPI锚有关29。研究表明,当PrPc变成PrPsc后,便失去以上功能。若进一步造成PrPc的缺如,即可出现相应的各种症状。5PrPsc的复制增殖这是作为蛋白质粒子的PrPsc,具有传染活力而成数百年神秘之谜的根本机理之一,各国学者对此研究十分活跃。他们发现,PrPsc引起的TSE,根据发病特征,大约85%为传染性病例(包括医源性及散发性),15%为遗传性病人。各类型朊病毒病中的PrPsc复制过程也有所不同。在传染性朊病毒病(如kuru病、vCJD等)中,外源性PrPsc在侵染机体后,首先与锚附在细胞表面的内源性PrPc(通常为PrP*)的C端第三个螺旋位点同源性特定AA相结合,形成杂合二聚体(heterodimer)。然后,在“X蛋白”1,30和盐酸胍、硫酸黏多糖、金属离子、脂类分子、BCL-2等蛋白质折叠因子及氧自由基27等作用下,以PrPsc为模板,自动催化以螺旋为主的PrPc转变成以折叠为主的PrPsc。这种“策反”式复制是一种瀑布型指数式增殖过程31,即一个分子PrPsc产生出2个分子PrPsc,2个PrPsc再去结合2个PrPc,共产生出4个PrPsc,如此周而复始。尽管PrPsc在“策反”PrPc的同时,其自身也可能会被机体细胞吞噬降解,但因这个过程要远比其“策反”速度缓慢,故最终仍使这种“策反”性复制可以继续,只是速度大打折扣,一般在脑腔中这一转变过程约需几个月,至少2个月时间1。近年发现,在脑组织中大量增殖的PrPsc主要沉积于脑灰质及灰质下白质的神经元突触、长纤维斑块及空泡中32,电镜下可见呈细胞碎片样的卷曲结构。在遗传性朊病毒病(如遗传性CJD、家族性GSS、FFI等)的患者细胞内,均存在发生突变的PRNP基因。Brown33、Gold-farb34等发现,家族性GSS、FFI患者PRNP基因中第178位密码子均发生突变,由表达天冬氨酸Asp178变成表达天冬酰胺Asn178,其他基因突变还见于密码子102、117、198、200等。这就每使本过度表达的PrPc不稳定性增高,当其在合成后进入内质网时,就开始表现出PrPsc的一些特点,后经加工,慢慢自发性地转变为PrPsc。此外,PRNP基因突变所表达的PrPc,对外来或自身已产生出的致病因子PrPsc特别敏感,比上述传染性朊病毒病者的PrPc,更易从螺旋转变为片层折叠,一次感染后半数个体均会发病。最近Collinge等35还发现因食“疯牛”肉类而患上vCJD的病人中, 80%以上均缺少一种人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA-DQ7),而后者可帮助免疫系统识别及排斥PrPsc,可见遗传因素在一些传染性朊病毒病发病风险上也起着重要作用。研究证实,由PrPc转变为PrPsc的过程是不可逆的结构转变,而一旦转变,也就具有了强抵抗力和异常复制增殖的能力。最终,PrPsc在神经元溶酶体中大量聚集而破裂,使大量神经元细胞发生P-淀粉样变性坏死及星状胶质长纤维细胞的大量增生,在脑组织中留下许多海绵状小孔和斑块,而坏死神经元细胞释放出的PrPsc又可袭击另外的神经元细胞,造成新的小孔,如此“蚕食”性进展,也是朊病毒病的重要病理特点。这个过程也是漫长的过程,短的几个月至几年,长的可达10多年甚至达30多年,构成临床上的超长“潜伏期”。6PrPsc的侵袭扩散6.1在淋巴网状内皮细胞系统的复制储存Mcbride用免疫组化法证实,小鼠感染PrPsc后,在最初几周内,首先通过肠道吸收进入肠道集合淋巴结和脾脏的淋巴组织中增殖36,其中除在T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞内均有较高水平表达外,特别是滤泡树突状细胞(follocular dendritic cell,FDC),既为PrPsc的重要复制场所,也可能是PrPsc的主要沉淀位点37。而B淋巴细胞所分泌的淋巴因子则是促进FDC成熟而维持其该功能的关键因子38。此时,在淋巴结、脾脏中的PrPsc含量可能已高于接种量的数10倍,而脑组织中还没检测到39。此外,在胸腺的指突状细胞、皮质上皮细胞以及胰腺的郎罕氏细胞内也可复制和沉积40,其他学者的蛋白印迹法、免疫金电镜法等实验也证实淋巴网状内皮细胞系统即为PrPsc在外周的主要储存和复制场所41,而巨噬细胞在早期可能有一定的阻止PrPsc沉积的作用42。6.2神经轴突输送链Bencsik、Glatzel、Beekes等研究证明,淋巴网状内皮细胞系统中的PrPsc,可以通过肠系膜神经节和与网状内皮细胞相邻的交感神经未稍纤维43(如脾交感神经纤维44),传到脊髓T7T9段,再沿着神经细胞的轴突逐渐向上、向下节段扩散开,直至脑部。从而形成“肠系膜神经节交感神经纤维脊髓脑”的扩散输送链。但该领域的研究报告还较少,故其确切途径尚待进一步证实。6.3血源性播散Fischer等发现45,人和小鼠血液中的纤溶酶原能在其赖氨酸位点上与PrPsc特异性结合,而携带其随血流播散。Hous-ton等46将感染了PrPsc的绵羊全血输给另一只健康绵羊,导致后者在数日后发病。日本科学家Tamai还发现47孕妇的胎盘血中有感染性疯牛病因子。这些都提示血浆有播散PrPsc的可能性,且能透过血脑屏障48、血胎屏障。英国政府于2003年12月宣布了首例疯牛病“疑似血液感染”病例49,该位英国病人1996年5月曾经在手术时接受输血,结果于2003年秋天患疯牛病死亡。经查实,供血者是一名已证实的疯牛病感染者。为此,英国卫生大臣约翰里德于2004年元月宣布,自2004年4月5日起,于1980年1月1日以来在英国境内接受过输血的任何人将不容许献血。7朊病毒病的防治对策据报道,英国从1986年爆发MCD至1996年全球禁止动物蛋白饲料出口的10年间,已向全球100多个国家(主要为北美、中东及亚洲)直接或间接出口牛羊肉及牛羊骨粉饲料200多万吨3!至2001年,已有12名英国人被确诊为因食用疯牛肉受传染而患上vCJD,并均在发病1年内死亡50,至今,全球报道共有150人死于这一病症49!有科学家预计,如不采取措施,MCD可能会和艾滋病一样成为全球性流行病,到2015年,仅在英国1年内就可能有20万人患上vCJD3!我国虽然目前还没发现MCD,但80年代也曾从英国等欧洲国家引进过羊和种羊,以及一些以羊、牛为原料的生化药品、试剂等(包括胎牛血清、小牛胸腺、羊胎素等),故我国发生TSE的风险仍然存在,必须积极采取预防措施。7.1预防措施禁止大量进口牛、羊等动物及其肉制品、血制品、免疫制品、动物蛋白饲料等。医疗器械尽量一次性使用,以防医源性传播。非一次性器械可浸泡在1N NaOH液中1 h,或132以上高压消毒1h,因为煮沸、环氧乙烷、过乙酸、三氯甲烷、苯酚、甲醛、射线、紫外线等对PrPsc均无效51。病牲畜头颅、尸体的最好处理办法为焚烧,因为PrPsc在干枯的大脑中能生存2年以上52,故对疑似或确诊的病人、畜尸体,均不宜作地下深埋处理。尽量不用牲畜组织提取激素等药物,应改用化学合成的激素等。7.2治疗进展朊病毒病至今尚无有效疗法,90%病例均在1年内死亡,故在朊病毒病治疗方面各国进行了大量的研究,并出现不少令人振奋的新苗头。目前已发现,蔗糖、海藻糖、二甲基亚砜、刚果红、多烯复合物、分枝多胺等,在体内、外均有抑制PrPc转化为PrPsc的活性,但大多难以透过血脑屏障(Blood-brain bar-rier,BBB)。美国加利福尼亚大学近年实验报告53,具有三环结构和中间有一脂肪族侧链的吖啶和吩噻嗪衍生物米帕林(抗疟药)、氯丙嗪等,既能透过BBB,也能抑制PrPsc与PrPc的结合与转变,还能消除已存在的PrPsc,现已进入实验性治疗阶段。米帕林和氯丙嗪的半数有效浓度(EC50)分别为0.3M和3M。在氯丙嗪、丙嗪和乙酰丙嗪浓度为210M水平下治疗6天,可使细胞内的PrPsc消失。利用能分解磷脂酰基肌醇的磷脂酶可将PrPsc从细胞膜表面除去;使用螯合剂可除去PrPsc分子中的金属离子,改变基蛋白酶抗性和致病性。这些都颇具开发潜力。根据PrP序列而人工合成的一些单克隆抗体,如anti-PrP219-232、Fab D18等,通过体内外试验也发现有抑制PrPsc与PrPc结合及转变的作用,有的还能清除机体中原有的PrPsc。但一般半衰期较短,透过BBB效率差。Soto等根据其以往研究中显示的缺乏脯氨酸的蛋白质易于形成折叠的现象,人工合成了一含有3个脯氨酸残基的13肽(iPrP13),用于小鼠和细胞实验后发现,不仅可抑制PrPc折叠,还可逆转PrPsc变成PrPc,可降低小鼠感染率91%95%。该13肽被称作“折叠破坏剂(breaker)”,也颇有治疗前景。8参考文献:1Prusiner SB. 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