化学热力学在生命科学中的应用研究.doc

化学热力学在生命科学中的应用研究 卢新生 苟如虎 张海玲 刘伯渠 王亚玲 甘肃民族师范学院化学与生命科学系,甘肃合作747000摘 要:综述了热力学中熵和自由能这两个重要状态函数在生命现象、肿瘤形成、抗癌药物研究、生物大分子结构研究、药物设计、蛋白质工程和基因优化表达等中的应用关键词:熵;自由能;生命科学;熵增加原理热力学是研究各种形式的能量转换规律的科学.热力学的基础是热力学第一定律和热力学第二定律.因为热力学研究的能量转换规律是自然界的一个基本规律.化学热力学是热力学原理在化学中的应用，它主要研究和解决化学变化过程中能量转化的规律、化学反应的方向和限度.人体是一个巨大的化学反应库，生命过程是建立在化学反应基础之上的一个非常复杂的体系.近半个世纪以来，生物学研究从整体开始，自上而下进入分子层次，而化学研究则自下而上地逐渐接触生物体，化学与生命科学在细胞以下、分子以上的区域相遇，在这个区域不断生长出了许多新的生长点，成为生命科学和化学的前沿领域.基于热力学原理的生命科学研究是一个新生长点，本研究综述如下。1熵与生命科学1.1熵与生命在化学热力学中熵是一个重要的状态函数.熵是系统混乱度的量度，系统的混乱度越大，熵值越大.熵变，S,只取决于体系的始态与终态,与过程无关.在孤立系统的任何自发过程中,系统的熵总是增加的,这是热力学第二定律的一种表达,也称为熵增加原理.生物是一个开放系统,开放系的熵决定于系统内产生的熵、外部流入的熵及系统流向外部的熵的数量. 比如,人体是一个开放系,其熵的改变由两部分之和决定,一是机体内产生的熵diS,二是流入的熵deS.于是总熵变化为ds=diS+deS.因为diS0,而deS取决于环境.当开放系统处在非平衡的稳态时dS=0,故有-deS=diS.从宏观来看,生命过程是一个熵增的过程,始态是生命的产生,终态是生命的结束,这个过程是一个自发的、单向的不可逆过程.衰老是生命系统的熵的一种长期的缓慢的增加,也就是说随着生命的衰老,生命系统的混乱度增大,当熵值达极大值时即死亡,这是一个不可抗拒的自然规律.但是,一个无序的世界是不可能产生生命的,有生命的世界必然是有序的.生物进化是由单细胞向多细胞、从简单到复杂、从低级向高级进化，也就是说向着更为有序、更为精确的方向进化，这是一个熵减的方向，与孤立系统向熵增大的方向恰好相反.但是生命体是“耗散结构”，耗散结构理论指出，系统从无序状态过渡到这种耗散结构有几个必要条件，一是系统必须是开放的，即系统必须与外界进行物质、能量的交换，二是系统必须是远离平衡状态的，系统中物质、能量流和热力学力的关系是非线性的，三是系统内部不同元素之间存在着非线性相互作用，并且需要不断输入能量来维持.2在平衡态和近平衡态，涨落是一种破坏稳定有序的干扰，但在远离平衡态条件下，非线性作用使涨落放大而达到有序.偏离平衡态的开放系统通过涨落，在越过临界点后“自组织”成耗散结构，耗散结构由突变而涌现，其状态是稳定的.耗散结构理论指出，开放系统在远离平衡状态的情况下可以涌现出新的结构.地球上的生命体都是远离平衡状态的不平衡的开放系统，它们通过与外界不断地进行物质和能量交换，经自组织而形成一系列的有序结构.可以认为这就是解释生命过程的热力学现象和生物的进化的热力学理论基础之一，在生物学，微生物细胞是典型的耗散结构. 下面考察大肠杆菌生长过程中熵的变化，为此我们利用熵的计算公式S=klogeP. k是玻兹曼常数，P是微观态数，熵S的单位是焦/度或卡/度，可以证明熵S和信息H只差一个常因子S=，kloge2，H，因此熵也可用比特来度量，两种的关系为比特10-23焦/度2.310-24卡/度，一个大肠杆菌含2.1104分子DNA，4,2104分子RNA，每个DNA或RNA分子平均长4000核苷酸，每个核苷酸有log24=2比特的信息量（因为有4种碱基），所以核酸信息量为5108比特，一个大肠杆菌含4.7108分子蛋白质，每个蛋白质平均有1000氨基酸，每个氨基酸有log220=4.3比特的信息量，所以蛋白质信息量为21010比特，两项合在一起，总信息量仍为21010比特.核酸、蛋白质的形式，好比发布信息，它具有的信息量为2x1010比特,这对应于210-13焦/度的熵,换句话说,由于序列形成中物质的有序化,系统的熵减少210-13焦/度,这里忽略了核酸、蛋白质以外其他大分子包括的信息,也没有考虑其他过程中产生的熵,如果核酸、蛋白质序列形成的热力学效率为12%,那么实际排出的熵应为210-13/0.12=0.1710-11焦/度,如何排出呢?熵是由于分子热运动,所以可通过向外界传递热量的方式使系统的熵减少,设细菌培养是在绝对温度310K进行,那么排出热量应为0.1710-11310=0.510-9焦,每个大肠杆菌的干重为6.710-13克,复制时间为1200秒,因此每克大肠杆菌成长过程中耗散热功率为0.6瓦,这个理论结果和实验完全一致.1.2熵增原理与肿瘤对于绝热体系中所发生的变化,Q=0，所以dS0不等号表示不可逆,等号表示可逆.也就是说在绝热体系中,只可能发生dS0的变化.在可逆绝热过程中，体系的熵不变在不可逆绝热过程中，体系的熵增加，体系不可能发生dS0的变化.一个封闭体系从一个平衡态出发，经过绝热过程到达另一个平衡态，它的熵不减少.这个结论是热力学第二定律的一个重要结果，它在绝热条件下，明确地用体系熵函数的增加和不变来封断不可逆过程和可逆过程.换句话说，在绝热条件下，趋向于平衡的过程使体系的熵增加，这就是熵增加原理.熵增加原理也可以解释肿瘤在人体内的发生、扩散.细胞基因癌变,造成人体正常基因组的异常活化，细胞无节制地扩增，使有序向无序转化，加速生命的耗散，熵值异常增大，在短期内熵值就增到极大值，人的生命便终止了.现代医学研究表明，癌基因以原癌基因的形式存在于正常生物基因组内，没被激活时，不会形成肿瘤.原癌基因是一个活化能位点，在外界环境的诱导下，细胞可能发生癌变，即肿瘤的形成是非自发的.非自发的过程是一个熵减的过程，也就是说肿瘤细胞的熵小于正常细胞的熵.然而肿瘤细胞是在体内发生物质、能量交换的，人体这个体系就相当于肿瘤细胞的外部环境，正是由于肿瘤细胞的熵减小，导致了人体这个总体系熵增大.越恶性的肿瘤，熵值越小，与体系分化越明显，使人体的熵增也相对越大，对生命的威胁越大.1.3熵增原理与抗癌药物的研究熵增原理对人们研究抗癌药物也有启发.例如利用体细胞杂交法可获得分泌抗体的杂交细胞系，当导入的抗体素抑制癌细胞的恶变、削弱它的增殖时，细胞本身的混乱程度将会减小，趋向于稳定的低熵状态，这就相当于给体系内部输送了负熵，使体系趋于有序状态.又如DNA是许多抗肿瘤药物的靶分子，这些药物通过嵌入、沟槽等方式与癌细胞的DNA结合，抑制肿瘤细胞的分裂增生，最终使肿瘤细胞增生停滞，或使其向正常细胞分化，或诱导肿瘤细胞发生程序性死亡，从而产生抗癌作用.阿霉素（ADM）这个抗肿瘤抗生素就是以典型的嵌入方式与DNA相互结合的，破坏DNA的模块功能，阻止转录过程，在抑制DNA、RNA蛋白质合成的同时，也改变癌基因的结构或影响癌基因的表达.由于AD-MDNA复合物比独立的DNA和ADM分子更有序，因此导致一定程度的熵减，有序度增加.2.自由能与生命科学在化学热力学中，自由能是一个很重要的状态函数，它是在等温等压及不作非体积功条件下化学反应自发进行的判据.如果G0，正向反应不能自发进行，而逆向反应能自发进行.自由能在化学中，按照亥姆霍兹的定容自由能F与吉布斯的定压自由能G的定义，G=F+ PV（p为压力，V为体积）.在生物的反应中，因为（PV）可以忽略不计，所以两者是相同的.2.1自由能与生物大分子结构研究2.1.1一种基于自由能的RNA二级结构的预测RNA在生命活动中有着重要作用，RNA的功能与其结构密切相关，因此研究RNA结构对理解RNA功能、原核基因工程和与RNA有关的生命现象有着重要意义.但RNA分子降解快、晶体难于获得，目前由于实验条件的限制，绝大多数RNA二级结构还不能用实验方法来测定.近年来，借助计算机预测RNA二级结构一直是很活跃的领域，不断推出了一些预测方法，测定了许多RNA分子的二级结构.基于自由能的RNA二级结构的预测认为，RNA二级结构是通过分子中碱基之间配对形成的，碱基之间的连续配对形成螺旋区,对RNA二级结构起着稳定作用,从而降低整体结构的自由能,而RNA分子中没有配对部分形成环状结构(发卡环、内部环、膨胀圈和多分支环),不利于结构的稳定,升高自由能,RNA二级结构的形成就是这种矛盾之间的一种平衡.预测RNA二级结构最常用的方法就是在各种可能的结构之间寻找最小自由能结构,而基本结构的自由能数据通过研究体外寡核苷酸稳定性获得.2.1.2通过自由能的差别划分蛋白质结构域蛋白质肽链从一级结构完全伸展的状态折叠成特定的三级结构,其折叠模式很复杂,蛋白质折叠问题是现代分子生物学的研究热点.结构域是蛋白质结构中普遍存在的一种结构单位,是介于二级结构单元和完整的蛋白质三级结构之间的一种结构层次,可以看作是蛋白质结构、折叠、功能、进化和设计的基本单位.大多数的蛋白质都可分为若干个结构域,结构域的不同组合使蛋白质具有不同的三级结构并具有不同的功能,结构域信息对于蛋白质结构解析在理论与应用上都具有重要意义.目前对蛋白质结构域的划分还没有一个十分理想的方法.20世纪90年代对蛋白质结构域划分主要是根据蛋白质的几何结构,通常通过目测用手工方法来划分,但已经远远不能满足以指数速率增加的蛋白质晶体结构数目.基于蛋白质结构域是折叠单位的设想,蛋白质结构域的折叠与去折叠形式具有不同的热力学能量状态,蛋白质结构域的折叠是由自由能变化驱动的.一般认为,天然蛋白质构象处于热力学上一个低能量态,如果认为结构域作为一种独立折叠单元,则应该不但结构上相对紧密,而且热力学能量上也必然处于较低能量状态,因此,用折叠自由能来划分结构域应该更为合理.基于自由能的蛋白质结构域划分得到了比较满意的结果.2.2自由能与药物分子设计2.2.1自由能与反义药物设计反义药物是用WatsonCrick碱基配对原理与靶mRNA结合,并通过降解靶mRNA干扰特定基因表达的寡核苷酸类药物.反义寡核苷酸必须能够与靶mRNA进行特异杂交,才能通过RNA酶H依赖机制等降解靶mRNA.能够接近靶序列并与之杂交是反义药物具有药效的首要条件,因此研究反义药物及其靶点的构效关系是研究热点之一.宋海峰等选择与肿瘤细胞增殖相关的蛋白激酶C(PKC)mRNA作为靶点,使用软件RNAstructure模拟mRNA二级结构,根据靶mRNA的一级与模拟的二级结构,选择二级结构自由能大于零的不稳定二级结构单元膨胀环、内环、发卡和假结等作为靶点进行反义药物设计.用肺腺癌细胞株A549评价反义药物的体外抗肿瘤生物活性,用软件SPSS进行多元回归分析.结果表明有效药物作用靶点相对集中地分布于由若干二级结构单元组成的局部二级结构区域,称之为“靶二级结构域(靶域)”.“靶域”结构相对稳定,但其中包含不稳定二级结构单元,即其自由能大于零.针对不同“靶域”设计的反义药物显示不同的生物活性(P0.01),但靶向同一“靶域”的反义药物生物活性无统计差别.结论提示“靶域”现象有助于反义药物靶点的选择,并对探针、引物设计及mRNA局部功能的研究具有重要意义.2.2.2自由能与直接药物设计中的分子对接直接药物设计是从生物靶标大分子结构出发,寻找、设计能够与它发生相互作用并调节其功能的小分子,分为分子对接和全新药物设计两种方法.分子对接法是通过将化合物三维结构数据库中的分子逐一与靶标分子进行“对接”,通过不断优化小分子化合物的位置、方向以及构象,寻找小分子与靶标生物分子作用的最佳构象,计算其与生物大分子的相互作用能.利用分子对接对化合物数据库中所有的分子排序,即可从中找出可能与靶标分子结合的分子.分子对接的核心问题之一就是受体和配体之间结合自由能的评价,精确的自由能预测方法能够大大提高药物设计的效率.在过去的20年中,随着受体和配体相互作用的理论研究以及计算机辅助药物设计方法的快速发展,自由能预测方法的研究受到了越来越多的关注.例如表皮生长因子受体(EGFR)和4苯胺喹唑啉类抑制剂的结合自由能预测.侯廷军等采用基于分子动力学模拟和连续介质模型的自由能计算方法,预测了EGFR和4苯胺喹唑啉类抑制剂的相互作用模式,分别预测了四种可能结合模式下EGFR和4苯胺喹唑啉类抑制剂间的结合自由能,最佳结合模式能够很好地解释已有抑制剂结构和活性间的关系.2.3自由能与蛋白质工程的长远目标就是要设计出具有任意功能或结构的全新蛋白在医学和生物学上往往需要蛋白质的某一功能却不满意该蛋白的另外一些特点,如高分子量、抗原性、不稳定以及不易折叠等,这些缺陷可以通过把蛋白质的功能区嫁接到另外一个合适的骨架蛋白得以弥补.国际上已发展了几种程序用于蛋白质功能嫁接的研究.2000年梁世德等报道了一种蛋白质表面功能区的嫁接.他们认为蛋白质的功能由表面区决定,其内核只起骨架作用.首先确定被嫁接的配体表面结合区的重要残基,在骨架蛋白中搜索适合于嫁接这些残基的位点.基于对映残基的C,C原子坐标,将骨架蛋白叠加到配体蛋白上,评估骨架蛋白与受体蛋白的互补性并留下互补性较好的骨架蛋白.细调骨架蛋白与受体蛋白的相对位置,使之具有合理的界面堆积密度,然后在骨架蛋白选出的位置上移植配体蛋白相应的残基.该方法被嫁接的功能区及骨架蛋白的选择是用蛋白质结构数据库(PDB)中大小与barstar相仿,残基数为81100的晶体结构或优化的平均核磁结构作为骨架蛋白(因barnase是一种110残基的胞外核酸酶,barstar具有异乎寻常的高亲和力,在25时结合自由能为-79.1kJ.mol-1,PDB中已存有Barnasebarstar的复合物晶体结构,是研究蛋白蛋白相互作用的理想模型),共有128个,进一步筛选出互补分数较高的4个代表性蛋白作进一步分析,即巯基蛋白酶抑制剂(1dvc)、质体蓝素(1plb)、转录起始起因子的DNA结合结构(2hts)以及barstar的核磁结构(1bta)4个蛋白,用打分函数计算这4个骨架蛋白的结合自由能,其中1plb的结合自由能为-81.6 kJ.mol-1,其结合自由能较低且平均偏差也小,是理想的骨架蛋白.得出了1plb和1bta同bar-nase优化后复合物的结构,结果较好.2.4自由能与基因诊断2.4.1自由能与人血管生成素基因的优化表达恶性肿瘤尤其是实体肿瘤的发生和发展都依赖于新生血管的不断形成,通过新生毛细血管为肿瘤提供必需的营养,带走肿瘤代谢产物,为肿瘤发展、转移提供必要条件.血管生成素(angiogenin,ANG)广泛存在于多种肿瘤组织中,在肿瘤发生的不同阶段刺激新生血管的形成,且肿瘤患者血液中ANG水平高低与肿瘤的恶性程度密切相关.如果能抑制ANG诱导的肿瘤血管形成,就有可能抑制肿瘤生长,甚至杀伤肿瘤细胞.利用基因工程技术生产血管生成素,对于研究血管生成素的作用机制及寻找抗血管生成素的药物具有重大价值,但是该基因在大肠杆菌中不能直接表达.路凡等根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能设计了AUG上下游序列,并利用RTPCR方法从人肺癌细胞系A549中扩增出起始区改造的ANG基因,成功构建了人ANG的高效表达菌株.该菌株经温度诱导后,SDSPAGE分析显示所表达的重组hANG蛋白质占细菌总蛋白质的30%以上,纯化后的ANG在体外能够有效地刺激鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成.结果表明,所设计的优化表达方法对人ANG基因的表达是成功的.2.4.2自由能与人白细胞介素在大肠杆菌中的优化表达人白细胞介素(interleukin4,IL4)是一重要的免疫活性调节分子,主要由Th2细胞产生,在T细胞、B细胞、巨噬细胞的增殖分化及功能调空方面起重要作用.近年来发现IL4在树突状细胞扩增培养中至关重要.而树突状细胞作为一种体内最强的抗原提呈细胞在抗肿瘤、抗感染免疫中具有不可忽视的作用.黄欣等根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能,设计了AUG上下游序列,并在人IL4基因下游插入部分大肠杆菌(E.coli)LacZ序列以提高mRNA的稳定性,成功地构建了人IL4的高效表达克隆,命名为pLCM182hIL4.经分析显示所表达的重组IL4蛋白质占细菌总蛋白的30%,且非常稳定,目的基因下游没有插入LacZ序列所构建的表达克隆pCZHhIL4在大肠杆菌中的表达量则占细菌总蛋白的20%左右.而后利用同样原理对人白细胞介素17进行优化表达设计也获得了同样的结果.因此该方法所设计的优化表达方法对人IL4基因的表达是成功的.3.结论综上所述,热力学原理与生命科学的相互渗透、相互融合,可以不断开拓热力学和生命科学的新的研究领域.参考文献:1