病毒感染的实验室诊断PPT专业课件.ppt

病毒感染的实验室诊断 1 病毒感染 实验室确诊的意义 2003年SARS爆发2008年手足口病的流行群体性发热临床工作中病原的确定及时准确的实验室确诊非常重要 2 3 Dengue登革热 麻疹可疑病例的临床诊断发热 38OC 出现斑丘疹和至少伴有以下一种症状 咳嗽 鼻炎或结膜炎 WHO EchovirusesEcho病毒 Measles麻疹 ParvovirusB19微小病毒B19 HHV 6 Rubella风疹 Others其它 4 内容 病毒感染的实验室诊断方法简介检测的结果分析EBV感染的血清学诊断 5 病毒感染的诊断方法简介 6 病毒感染的诊断类型及方法 7 病毒感染的临床过程与诊断 8 ELISA的原理 病毒抗原 抗体包被在固相载体表面加入待检血清 抗原抗 体复合物洗涤 加入酶标记抗人免疫球蛋白 与抗原抗体复合物特异性结合洗涤 加入底物显色 测OD值 9 10 ELISA结果的判定 目测法 一般加底物后 肉眼下出现颜色的为阳性 无色为阴性临界值法 以标本OD值 阴性对照平均OD值加2 3个标准差作为阳性结果的阈值S N值法 以S N值 2 1为阳性 S N值 2 1而 1 5为可疑 S N值 1 5为阴性 11 免疫荧光法 间接法和直接法间接法1 固定2 冲洗3 与第一抗体结合4 与第二抗体及免疫荧光抗体结合5 冲洗6 封片 观察 12 DEAFFtestforCMV VirologyLaboratory Yale NewHavenHospital 13 PCR 一 PCR基本原理PCR是一种快速和简便的DNA体外扩增技术 在模板DNA 引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下 利用耐热DNA聚合酶进行聚合反应 经变性 退火及延伸三步骤多次循环 对特定DNA模板进行扩增 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性 14 PCR的要求 目的基因的序列设定引物PCR实验要求的原料 引物 酶 dNTP Mg 模板及缓冲液 15 PCR一次循环包括三个基本步骤 1 变性 denaturation 加热至90 96 C DNA双链模板变成单链2 退火 annealling 缓慢降温至30 65 C 引物与单链DNA模板互补结合3 延伸 extention 升温至70 74 C DNA链延伸 需TaqDNA聚合酶 dNTP Mg2 循环30次 特异DNA产量达230拷贝 约109 PCR基本步骤 16 PCR扩增靶DNA示意图 双链靶DNA 变性 退火 延伸 5 3 5 3 5 5 3 3 17 18 19 PCR反应步骤 预变性 退火 延伸 变性 20 PCRanimation 21 常规PCR产物确认 22 荧光定量PCR 23 荧光定量PCR的标准曲线 24 病毒分离 标本接种于敏感细胞观察细胞病变病毒的鉴定 PCR IF等 25 CytopathicEffect Cytopathiceffectofenterovirus71andHSVincellculture notetheballooningofcells VirologyLaboratory Yale NewHavenHospital LindaStannard UniversityofCapeTown 26 检测结果的分析 27 一 血清中特异性IgG和IgM的意义 单份血清特异性IgG阳性 只能说明过去有过病毒感染 而不能确定最近感染 只有在发病初期检测不到抗体或滴度低 而恢复期抗体4倍以上升高才有诊断意义 测定单份血清中的特异性IgM抗体 有助于疾病的早期快速诊断 但临床诊断中要结合病程 临床表现和病毒类型综合考虑 28 TypicalSerologicalProfileAfterAcuteInfection Notethatduringreinfection IgMmaybeabsentorpresentatalowleveltransiently 29 检测IgM应注意的问题 持续的IgM反应 如风疹 CMV等早期妊娠感染或先天性感染的儿童 特异性IgM可能持续达1年或更长时间IgM型抗体阴性 1 病程 风疹 出疹后第1天 45 能查到IgM 麻疹 出疹后3天内 70 左右能查到IgM2 病人的免疫功能 免疫抑制病人 30 3 局部感染4 隐性感染的再激活和再次感染 EBV CMV等人疱疹病毒 产生的特异性的IgM少 应查双份血清的特异性IgG 多种病原体IgM抗体同时阳性1 IgM持续时间2 交叉反应 肠道病毒 黄病毒 31 二 PCR检测结果的分析 PCR检测阳性 并不一定说明是病原或活动性感染 要结合临床 标本来源等综合分析可能是正常携带病毒或潜伏感染 如肠道病毒 正常人粪便中可以检测到 但脑脊液中检测阳性则有临床意义 32 CMV尿荧光定量PCR阳性不能用于判断疗效和指导治疗 但血清中定量PCR与病情严重程度相关PCR检测阴性 要结合临床病程分析呼吸道病毒感染 肠道病毒感染一般7 10天后可能检测不到病毒核酸 33 三 病毒分离结果 敏感性较低结合临床病程 症状体征和标本来源综合判定 1 阳性结果 是否与临床相符 SARS与衣原体 2 阴性结果 是否病程已过急性期 34 儿童手足口病患者病原检测 35 原发性EBV感染的诊断 36 人类疱疹病毒 37 Burkitt slymphomainKenya Epstein Barrvirus EBV 1964 discoveredfromBurkitt slymphomatissuebyEpstein Achong andBarr1968 theetiologicagentforinfectiousmononucleosis1970 nasopharyngealcarcinoma1980 non Hodgkin slymphoma 38 EBV相关疾病 传染性单核细胞增多症 Infectiousmononucleosis IM 慢性活动性EB病毒感染 ChronicactiveEBVinfection CAEBV EB病毒相关性嗜血细胞综合征 EBV associatedhemophagocyticsyndrome EBVAHS 39 伴性淋巴增殖综合征 X linkedlymphoproliferativesyndrom 鼻咽癌 Nasopharyngealcarcinoma Burkitt s淋巴瘤 Burkitt slymphoma 何奇金淋巴瘤 Hodgkin slymphoma 40 41 EBV IM的临床表现 发热 约1周 严重者2周或更久 幼儿可不明显淋巴结肿大 任何淋巴结 颈部最易受累咽炎 50 有渗出物 25 上腭有瘀点脾肿大 病程2 3周 50 出现肝炎 肿大10 15 而GPT升高80 皮疹 红斑 斑丘疹或麻疹样疹 50 可有眼睑浮肿 42 EBV IM的临床表现 其它 1 间质性肺炎2 CNS 脑炎 格林 巴利综合征等3 心肌炎4 血液系统 溶血性贫血 再障 粒细胞减少5 肾炎6 关节炎7 胰腺炎 43 EBV抗体四项 VCA IgGVCA IgMEA IgGNA IgGVCA IgG亲合力 44 衣壳抗原 CA IgM 一般情况下 一周左右升高 持续存在4 8周 类风湿因子和IgG抗体可致结果假阳性临床要注意以下情况 1 有的病人抗EB病毒CA IgM产生延迟2 少部分病人感染EBV后 CA IgM持续阴性3 也有的病人CA IgM持续几个月阳性 45 抗体亲合力检测 机体在受到病原体入侵时首先产生低亲合力抗体 随感染的继续和进展 抗体亲合力升高 因此 低亲合力抗体的检出提示原发性急性感染 原发EBV感染 100 的病人在第一个月内可检测到抗EB病毒CA IgG低亲合力抗体 46 47 病程 周 月 抗体滴度 早期阶段 晚期阶段 症状 原发性EBV感染的体液免疫 48 晚期 早期 复发 病程 周 月 抗体滴度 EBV感染的再激活 恢复期 49 体液免疫的特殊情况 50 220例IM病人血清中EBV抗体四项结果 51 EBV抗体四项结果分析1 52 EBV抗体四项结果分析2 53 1 4 2 5 3 1 说明 图1为VCA IgG 阳性 图2为VCA IgG 提示为低亲和力 图3为VCA IgM 阴性 图4为EA IgG 阴性 图5为NA IgG 阴性 病程4天外周血EBV抗体结果 54 病程8天外周血EBV抗体结果 说明 图1为VCA IgG 阳性 图2为VCA IgG 提示为低亲和力 图3为VCA IgM 阳性 图4为EA IgG 可疑阳性性 图5为NA IgG 阴性 1 2 3 4 5 55 说明 上二图中 从左到右 前4条曲线为标准品 第5条曲线为病程8天 CT值为19 73 EBV DNA为8410 54拷贝 ml 第6条曲线为病程4天 CT值为24 00 EBV DNA为413