不同饲养模式对黄山黑鸡J亚群禽白血病.doc

不同饲养模式对黄山黑鸡J亚群禽白血病、鸡白痢感染率的影响摘 要在黄山大部分地区都有饲养黄山黑鸡，且多分布在山区，目前主要位于黟县和祁门县边界处，是该地山区农民放养的多种地方鸡之一。该品种经过长期人工选育和自然驯化，具有性情活泼，耐粗饲，觅食性、就巢性、适应性强等特点，是安徽黄山特有的珍贵品种，其味道鲜美，滋补性强。论文通过对笼养和放养模式下黄山黑鸡J亚群禽白血病和鸡白痢感染情况的跟踪检测，同时对其繁殖性能进行评价。选择同一批黄山黑鸡种鸡600只，在母鸡见蛋后随机分为两组，每组各300只，分别进行笼养（:=1:15）和山地放养（:=1:10）。采用ELISA法、血清平板凝集法试验和种蛋孵化试验等对两种饲养模式黄山黑鸡白血病、鸡白痢、种蛋的蛋品质和繁殖性能进行了对比分析。结果显示：1、笼养组种鸡200日龄肛拭子阳性率为19.6%，其中公鸡为21.9%，母鸡为18.3%；放养组种鸡肛拭子阳性率为7.8%，其中公鸡为14.7%，母鸡为3.6%；笼养组300日龄蛋清P27抗原阳性率为7.8%，放养组为3.3%；笼养组子代1日龄雏鸡胎粪阳性率为3.4%，放养组为2.9%。结果表明，笼养组种鸡白血病阳性率高于放养组，且公鸡阳性率普遍高于母鸡，其子代笼养组的阳性率同样高于放养组；2、比较两种饲养模式黄山黑鸡鸡白痢感染情况，对黄山黑鸡231日龄、251日龄、274日龄、301日龄和327日龄的血清进行了检测，笼养组各日龄鸡白痢阳性率分别为0%、1.01%、2.38%、1%和0%，放养组为7%、7.44%、3.13%、2%和1%。放养组鸡白痢阳性率高于笼养组；3、比较两种饲养模式黄山黑鸡的蛋品质差异，对种蛋的蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳颜色进行了测定。结果表明，不同饲养方式黄山黑鸡种蛋的蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳颜色之间存在显著差异（P0.05）。笼养组蛋重为48.1 g，显著高于放养组（P0.05），蛋壳厚度为0.423 mm，显著高于放养组（P0.05），蛋壳颜色为41.3，蛋壳颜色深度明显高于放养组（P0.05）；而放养组种蛋的蛋形指数为1.31，明显高于笼养组的1.29（P0.05）。对两种饲养模式下的黄山黑鸡种蛋孵化出的雏鸡体重进行测定，结果表明笼养组和放养组种蛋孵化出的雏鸡体重呈显著差异（P0.05），笼养组雏鸡平均体重以及公、母平均体重分别比放养组高1.91 g、1.78 g、1.97 g，达差异显著水平（P0.05）。在做孵化时，统计每组种蛋的孵化指标。结果表明，放养组笼养组种蛋受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率分别为93.98%、96.94%、91.10%，放养组的分别为93.46%、95.52%、89.26%，笼养组黄山黑鸡种蛋的死胚率为3.06%，放养组的为4.48%，笼养组的各项指标均优于放养组。本试验初步掌握了两种饲养模式黄山黑鸡J亚群禽白血病和鸡白痢感染情况及繁殖性能，为黄山黑鸡种源性疾病净化与防控提供基础。关键词：黄山黑鸡；J亚群禽白血病；鸡白痢；繁殖性能AbstractHuangshan Black Chicken is one kind of multiple places chicken groups that was grazed by the local mountain farmers, it is distributed in most parts of huangshan city, and relatively concentrated distribution in Yixian county and Qimen county border area. It has showed the characters such as disposition lively, crude feed tolerance, strong adaptability,high broodiness and so on after long-term artificial selection and natural domestication. Huangshan Black Chicken is a rare species with tasty flavor and tonic effect of Huangshan Anhui province.In this thesis, a tracing detection was conducted about the infection status of avian leukosis subgroup J and pullorosis of cage-rearing and free-range feeding modes of Huangshan black chicken,and a evaluation was conducted of reproduction performance of Huangshan Black Chickens of the two feeding modes. 600 Huangshan Black Chickens breeders were randomly divided into two groups after the hens lay eggs, cage-rearing group and free-range group. ELISA, plate agglutination text and hatching experiment were used to contrast the avian leukosis, pullorosis positive rate, breeding egg quality and reproduction performance of Huangshan Black Chickens between the two groups.the results showed that: 1. The cage-rearing group 200-day-old breeding birds positive rate in cloacal cotton swab was 19.6%, p27 antigen positive rate in cockscloacal cotton swab was 21.9% and the hens was 18.3%; The free-range group p27 antigen positive rate in cloacal cotton swab was 7.8%, p27 antigen positive rate in cocks cloacal cotton swab was 14.7% and the hens was 3.6%; The cage-rearing group 300-day-old breeding birds p27 antigen positive rate in egg white was 7.8% while the free-range groups was 3.3%;The p27 antigen positive rates in 1-day-old meconium of the cage-rearing group offspring and the free-range groups was 2.9%. The results showed that the positive rate of avian leukosis of cage-rearing group was high than that of free-range group, and the positive rateof avian leukosis of cocks was generally higher than that of the hens, similarly, the positive rate of avian leukosis of cage-rearing group offspring was high than that of free-range group. 2. In order to contrast the pullorosis positive rate between the two feeding modes, the blood serum of 231-day-old, 251-day-old, 274-day-old, 301-day-old, 327-day-old Huangshan Black Chicken were investigated. The results showed that all the day-old pullorosis positive rates of cage-rearing group were 0%, 1.01%, 2.38%, 1%, 0% and free-range groups were 7%, 7.44%, 3.13%, 2%, 1%. Pullorosis positive rate of cage-rearing group was high than that of free-range group. 3. In order to contrast the egg quality between the two feeding modes, egg weight, egg shape index, egg shell thickness and eggshell color were measured. The results showed that the egg quality between the two feeding modes was significantly different (P0.05). The egg weight of cage-rearing group was 48.1 g,which significantly higher than that of the free-range group(P0.05).The eggshell thickness of cage-rearing group was 0.423 mm, which significantly higher than free-range group(P0.05).The egg shell color depth of cage-rearing group was 41.3, which significantly higher than that of the free-range group(P0.05). But the egg shape index of free-range group was 1.31, which significantly higher than that of the cage-rearing group(P0.05). The weight of chicks that were hatched by the breeding eggs of the two feeding modes was measured. The results showed that the chicks weight of the two feeding modes was significantly different(P0.05). The average weight of chicks, cocksand hens of cage-rearing group were 1.91 g、1.78 g、1.97 g heavier than that of free-range group, it has reached a significant difference level(P0.05).The incubation indicators of the two feeding modes were recorded when the incubation experiment was carried out. The results showed that the fertility rate of hatching egg, fertilization and hatching rate of cage-rearing group were 93.98%、96.94%、91.10%, the free-range groups were 93.46%、95.52%、89.26%, the death rate of embryo of cage-rearing group was 3.06%, and the free-range groups was 4.48%, the indicators of cage-rearing group were better than that of the free-range group.In the study, the infection status of avian leukosis subgroup J and pullorosis, and reproduction performance of Huangshan Black Chickens of the two feeding modes were investigated, which provided the fundamental for the purification and prevention of provenance disease of Huangshan Black Chickens.Key words: Huangshan Black Chicken; avian leukosis subgroup J, pullorosis; reproduction performance目录摘 要IAbstractIII英文符号及缩略词VII文献综述11 黄山黑鸡12 饲养模式12.1 鸡的不同饲养方式12.1.1 笼养12.1.2 平养22.1.3 放养23 J亚群禽白血病23.1 病原学33.1.1 分类33.1.2 形态及理化特性33.1.3 基因组结构33.2 流行病学43.3 临诊症状及病理变化53.4 危害53.5 诊断和检测53.5.1 病毒的分离和鉴定53.5.2 血清学检测方法53.5.3 分子生物学检测方法63.6 防治64 鸡白痢64.1 病原学74.2 流行病学74.3 临诊症状及病理变化74.4 危害74.5 诊断和检测84.5.1 细菌的分离和鉴定84.5.2 凝集试验法84.5.3 ELISA方法84.5.4 PCR方法84.6 防治94.6.1 预防措施94.6.2 治疗9引言101.1 试验材料171.1.1 试验动物171.1.2 主要试剂171.1.3 主要仪器设备171.1.4 主要溶液配制171.2 试验方法171.2.1试验动物分组171.2.1 样品的采集与处理171.2.2 泄殖腔棉拭子、蛋清和胎粪样品中ALV P27抗原ELISA的检测181.2.3 鸡白痢的检测191.2.4 种蛋的孵化191.2.5 数据处理与分析192.1样品的采集结果202.1.1泄殖腔棉拭子、蛋清及胎粪样品202.1.2血清样品202.2 在不同饲养模式下的黄山黑鸡禽白血病检测结果202.3 在不同饲养模式下的黄山黑鸡鸡白痢检测结果222.4 不同饲养模式对黄山黑鸡种蛋蛋品质的影响232.4 不同饲养模式对黄山黑鸡雏鸡体重的影响232.5 不同饲养模式对黄山黑鸡孵化性能的影响233 讨论214 结论23参考文献24 英文符号及缩略词英文缩写英文全称汉语名称ALVAvian leukosis Virus禽白血病病毒ALV-JJ subgroup of Avian leukosis VirusJ亚群禽白血病病毒RSVAvian Sarcoma Virus禽劳斯肉瘤病毒LLLymphoid Leukosis淋巴细胞性白血病NCNeuleocapsid核衣壳RTReverse Transcreptase反转录酶INIntegrase整合酶PRProtease蛋白酶SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠kbkilobase一千个碱基envenvelope gene囊膜蛋白基因polprotease/polymerase蛋白酶/核酸聚合酶gaggroup antigen群抗原LTRLong Terminal Repeat长末端重复序列gp85 glycoprotein 85糖蛋白 85 gp37glycoprotein 37糖蛋白 37SUSurface protein表面蛋白TMTransmembrane protein穿膜蛋白CEFChicken embryo fibroblast鸡胚成纤维细胞ELISAEnzyme Linked Immuno Sorbent Assay酶联免疫吸附试验p27protein 27衣壳蛋白IFAImmunofluorescence间接免疫荧光法PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应PDPullorum diseases鸡白痢SPSalmonella pullorum鸡白痢沙门氏菌bp base pair碱基对PBS Phosphate-Buffer Saline磷酸盐缓冲液min minute分钟mol/L mole per liter 摩尔/升g gram克mL milliliter毫升cm centimeter 厘米Lmicroliter微升nm nanometer纳米r/min rotation per minute每分钟转数31文献综述1 黄山黑鸡黄山黑鸡的主要产区为安徽省黄山市，该地区主要为丘陵地带，根据其地理位置可将其归为亚热带湿润性季风气候，具有降水量充足、四季分明的特征。在黄山大部分地区都有饲养黄山黑鸡，且多分布在山区，目前在黟县和祁门县的边界处较多，在黟县柯村，饲养量最多，该鸡种是当地劳动人民长期的人工选择和自然驯化后形成的，具有活泼的气质特点，耐粗饲，寻找食物和就巢性，适应性强，等，受到当地农民的亲耐。黄山黑鸡是该地山区农民放养的多种地方鸡之一。独特的自然地理环境和人文地理环境对黄山黑鸡品种的形成发挥了重要作用。黄山黑鸡的公鸡躯体为马鞍形，背呈U型，羽毛为黑色，短而圆的头，脸部，肉垂和耳叶红色，冠主要为单冠，冠红色，齿5到7个。无胡须，喙呈青黑色或青色；母鸡体型较小，呈马鞍形，尾部较直，全身黑羽，头部短圆，肉垂和耳叶为鲜红色，且较公鸡略小。冠主要为单冠冠，冠红色，齿5到7个。虹彩橙黄色，喙青黑色或青色。皮肤为白色。雏鸡全身绒毛呈灰黑色1。2 饲养模式由于国民生活和消费水平的日渐升高，人们的饮食结构和消费观念也有所改变，对畜禽产品的质量要求更高。如今，肉品质优劣主要取决于风味、营养价值和安全性等因素。人们的生活习惯决定了肉和蛋的消费占消费的比重较大，但随着城市化进程的加速，土地资源的减少、环保和其他因素，制约了以往的养殖模式，鸡病种类增加，疾病的程度增加。同时，为了追求经济效益最大化，在舍饲养殖过程中使用药物治疗，并出现激素催熟现象，使得鸡的健康状况有所下降。笼养鸡虽然成本较低，但质量和安全性却令人担忧2；传统放养鸡的品质好，但养殖成本高，且易发生各种传染病3。2.1 鸡的不同饲养方式近年来，我国的养鸡产业集约化程度增加。鸡的养殖模式已经从农户放养发展为集约化、规模化的饲养模式，且比较成熟，目前我国养鸡业应用较多的饲养方式有笼养、平养、放养等饲养模式。2.1.1 笼养笼养鸡笼的种类有多种，主要由金属丝制成。笼养能够增加鸡的饲养数量，鸡群管理集中，生产效率高，饲料营养全面且合理，饲料利用率较高；其生长速度较快，减少了饲养时间，提高成活率，在数量上能够满足不断增加的消费需求，利于增加经济效益；同时，便于加强饲养管理，统一防疫，减少疾病发生机率，特别是对预防球虫病大有好处。但由于高密度和环境条件的影响，容易引起鸡群的啄癖，腿病，胸囊肿病，且鸡群缺乏自由4。2.1.2 平养平养包括地面垫料平养、网上饲养和混合地面饲养三种方式。地面垫料平养的垫料原料有锯末，稻壳，秸秆，干草等，在鸡群淘汰或出栏后，彻底清除更换垫料。该方式可以提高鸡舍温度，利于仔鸡抵御严寒；腿病和胸囊肿发生率较笼养低5；比较适合于中小型鸡场和养鸡专业户。网上平养是将鸡群置于离地面有一定高度的网上地面进行饲养，这种方式可以改善鸡群的生长环境。网上平养以手动操作为主，也可装配自动饮水、喂料、清粪等设施。有研究表明该方式与笼养方式对鸡的死亡率和饲料利用率几乎无影响5。2.1.3 放养放养是将鸡放在大棚或林地中，让鸡群在这些环境下有充足的活动空间，自由觅食的一种方式。放养鸡群大部分时期在舍外活动，夜间回舍栖息。在该饲养方式下，鸡群可以获得充足的光照和活动空间，同时觅食到的自然蛋白和青绿饲料营养价值高，维生素、微量元素、脂肪酸等含量丰富。由于补料中未添加任何药物、抗生素和激素等化学物质，产品具有品质高、无药残、无污染等特点，市场效益好6。但由于养殖技术落后，养殖户依旧沿用以往的传统饲养方式，导致鸡群中疫病频频发生，造成养殖户养鸡积极性下降和严重的经济损失，阻碍了放养模式的发展和提升。侯庆文等7认为生态养殖是一种高效的养殖模式，且在生态环境保护方面发挥了积极作用。缺点是需要一定的放牧场地，饲料利用率低，同时由于采食的局限性和运动量较大而显著降低了生长速度。孔新荣等8认为，生态放养的场地要求地势高、干燥、坡度缓、避风、光照和水源充足，场地周围布置围栏。场地一般选择在果园或林地较好好。目前国内关于放养的相关研究较少，只对管理方法和经济效益进行了研究。国内已有报导在田间、山地、树林等放养模式6。3 J亚群禽白血病禽白血病（Avian Leucosis)主要是由禽白血病病毒（ALV）和禽肉瘤病病毒（RSV）引起禽的肿瘤疾病的总称9。根据临床症状的不同，可分为多种肿瘤10。其中大部分肿瘤都和造血方面相关，很少可以损害其他组织11。该病可引发鸡的许多传染性肿瘤12。根据病毒囊膜蛋白的抗原差异、宿主范围、病毒-血清中和实验和病毒间的相互干扰模式，将病毒分成AJ 10个亚群13，A、B、C、D、E、J 6个亚群可以引起鸡群感染。A、B、C、D、J为外源性病毒，A、B亚群病毒在鸡群中最普遍，且A亚群较B亚群流行更广；C、D亚群很少出现，但对鸡也有致病作用；E亚型在鸡体内是以前病毒形式存在，但致病性很弱14,15。禽白血病是造成早期养禽业经济损失的主要原因，随着养禽业养殖规模的扩大和科学技术的发展，禽白血病的危害已不容忽视，在上世纪80年代前后，世界上主要的大型养禽公司经过长期净化，已基本上将禽白血病净化干净，且病毒在遗传上也表现出相对稳定16,17。但在1988年，在英国发现了一种致毒性更强的ALV毒株，可引起鸡各脏器（特别是肝脏）的骨髓细胞瘤，且从正常肉种鸡和一个病鸡中分离到几株禽白血病病毒18。Payne等在此发现的基础上作了进一步研究，结果表明先前分离到的几株禽白血病病毒属于一个新的亚群，并进一步研究了HPRS-103株，对J亚群的研究起到了重要作用19，ALV-J的发现再次给肉鸡业的发展带来严重影响。随后，J亚型禽白血病很快爆发并广泛传播，在世界许多地区均报道发现ALV-J病例20,21,22。1999年，我国在肉鸡中发现 ALV-J23，由此证明ALV-J在我国鸡群中的存在。随后，该病在全国范围内迅速爆发和传播，且蛋鸡以及地方品种鸡也有感染。徐镔蕊等在蛋鸡中分离检测到该病毒24。成子强等在国内地方品种鸡中检测到ALV-J25。目前，J亚型禽白血病是我国养鸡业的一种重要传染病。3.1 病原学3.1.1 分类ALV-J在最新分类中被归为反录病毒科-反转录病毒属9。该病毒的特点主要是有病毒复制方面的酶。3.1.2 形态及理化特性ALV-J病毒在构造上与其他RNA病毒类似，呈两股线状结构26。病毒粒子呈球状，从外到内依次为球状纤突、外层膜、中层膜和核芯，病毒表面有突起，直径8 nm，构成了病毒糖蛋白。病毒的核芯结构由二倍体 RNA及各种酶（NC、RT、IN、PR）构成，在核芯内部有较密的电子分布，直径约为 3545 nm，呈二十面体对称分布27,28。病毒在负染后，为球形粒子，在干燥的环境中会发生变形29。禽白血病病毒对热敏感，可通过高温灭活，只有在-60 以下时, 病毒才能被保存数年而不丧失其感染力30。病毒全部化学成分包括 6065%蛋白质，其中 5%7%的糖蛋白，脂质占病毒的30%35%，RNA 占 2.2%，还有少量可能来自宿主细胞的 DNA31。脂溶性溶剂可破坏病毒囊膜，从而使病毒失去感染能力32，在经过SDS处理后，病毒可发生裂解。ALV-J在pH 59时相对稳定，超出此范围则很快失活33。蛋白酶能够去除病毒粒子表面的部分糖蛋白，但对紫外线具有很强的抵抗力34。3.1.3 基因组结构ALV-J病毒是RNA病毒中的一种，病毒基因组结构为两条相同的单链RNA，两个完全相同的单链RNA分子长度在7.2 kb7.8 kb之间35，RNA通过反转录形成前病毒（cDNA）。病毒的基因组在RNA分子中的顺序为 5gagpolenv3，非编码区位于基因组两端，在5端有帽子（m7GpppGmp）结构，在3端有多聚A（Poly A）结构；编码区位于中间，由gag、pol和env基因组成，病毒的结构蛋白和有关的酶主要由这些基因负责编码。前病毒DNA与病毒 RNA的基因组序列相同，两端的重复序列（LTR）结构对病毒 RNA的复制和翻译有重要作用36。ALV-J亚群的gag基因与AE亚群相似性很高，在96%以上，且为保守序列37，编码的抗原主要有 p27、p19、p15、p12、p10和p238。p27是禽白血病病毒各亚群共有的群特异性抗原，占病毒蛋白比例较大，目前主要通过检测该抗原来判断鸡群感染ALV-J情况。但是该方法无法判断病毒的内、外源性39，因此在检测时应选择合适的材料。pol基因也为保守序列，编码两个酶：病毒反转录酶（RT）和病毒整合酶（IN）。反转录酶负责以病毒RNA为模板产生前病毒DNA，是病毒生活周期中所必需的40；整合酶参与将前病毒DNA整合到宿主染色体，对病毒的复制有着极其关键的作用41。env基因不同于gag和pol，有高度可变性42，编码gp85和gp37两种蛋白，病毒蛋白由二者相互连接构成。gp85为表面蛋白（SU），主要起识别细胞受体作用，同时也能诱导鸡体产生抗体43,44。gp37是病毒的穿膜蛋白（TM），起到转运作用。有研究表明，与gp85基因的同源性，A、B、C、和D四个亚群是80%85%，而J亚群的为40%45,46,47；与gp37基因的同源性，A、B、C、和D四个亚群是92%95%，但J亚群为65%11,48。3.2 流行病学J亚群禽白血病分布范围广泛，对鸡群危害严重，且在临床上表现出明显症状的较少49。感染J亚群禽白血病的鸡可发生死亡，鸡群的生产性能也会普遍降低。鸡是该病毒的自然宿主50。母鸡较公鸡在该病的流行中发挥的作用较大，感染的公鸡对后代的先天感染无影响51。但公鸡是重要的传染源52。ALV-J具备两种方式进行传播：经蛋的垂直传播和在鸡群间接触的水平传播53。其中主要的传播方式为垂直传播，可以使感染经代间传播。健康鸡在与先天感染鸡密切接触后可获得感染，该病毒不耐高温，在外界很难存活，因此不易通过间接接触而感染。ALV-J在肉鸡中的传播速度快，传播效率高于其他外源性ALV，并能使鸡群产生免疫耐受（持续的病毒血症和缺乏抗体），可持续排毒并通过种蛋造成垂直传播54。感染的胚胎在经过孵化后，可在出壳后的雏鸡血液中检测到大量的病毒，成年母鸡可把病毒传给子代。在受到感染的鸡胚胰腺腺泡细胞内可检查到大量病毒55，病毒颗粒可通过雏鸡胎粪排出，传染性很强56。3.3 临诊症状及病理变化发病鸡无明显症状，病鸡消瘦、体质虚弱、食欲不振、鸡冠苍白等。在蛋鸡中，主要表现为在产蛋高峰期前后，鸡的死淘率明显升高。肝脏和脾脏肿大，严重的肝脏可达到数倍之大。有明显症状的在短时间内就可死亡。剖检病鸡可见肝脏、胸骨、心脏、肾脏、卵巢、腺胃等组织有许多黄白色肿瘤结节。3.4 危害禽白血病的发病率和死亡率通常较低57，ALV-J 常常可引发鸡群的骨髓细胞瘤（ML）。我国在蛋鸡中发现ALV-J后，该病的发病率明显上升 58,59。虽然本病的发病率不高，但可引起鸡的生产性能下降和免疫抑制。在鸡的生长性能方面主要影响产蛋量和蛋品质60，开产延迟、蛋的质量下降、受精率低和孵化率下降等，从而对养鸡业造成严重的经济损失61。鸡群感染ALV-J后，会产生免疫抑制，从而导致一些免疫抑制病的发生。最近的研究发现，ALV-J能与其他免疫抑制性病毒发生共感染，从而造成更为严重的经济损失62,63,64 。3.5 诊断和检测禽白血病主要根据临诊症状及病理变化来进行诊断，且注意区分与马立克氏病的不同 65。另外以下几种方法也是进行禽白血病诊断必须借助的方法66。3.5.1 病毒的分离和鉴定在诊断禽白血病的多种方式中，病毒的分离和鉴定是一种传统的检测方法，被认为是检测ALV-J最实用的方法67。蛋清、10日龄鸡胚、病鸡血清、血浆和粪便中均含有病毒，都可作为病毒分离的材料。在检测这些分离的材料时，可将鸡胚或鸡胚成纤维细胞作为病毒分离和增殖的载体，病毒复制后利用以下方法进行检测。抗力诱导因子试验：感染ALV-J的CEF细胞在受到同亚群肉瘤病毒的叠加感染时不产生病变。非产毒细胞激活试验：该试验的原理是：经囊膜缺陷性禽肉瘤病病毒毒株转化成的细胞，无传染性禽肉瘤病病毒的产生，但在用ALV-J叠加感染后产生了传染性禽肉瘤病病毒，将其感染鸡胚成纤维细胞后便可测出68。表型混合试验：本试验原理是C/O（对所有亚群均易感）CEF细胞感染E亚群禽肉瘤病病毒后，会产生转化细胞，在进行叠加感染时，若材料中含有其他亚群的白血病病毒，便可产生其他亚群的禽肉瘤病病毒，这可以通过C/E CEF来测定69。3.5.2 血清学检测方法血清学检测方法敏感性高、可操作性强且经济适用，在ALV-J的检测中最为常用。而在血清学检测中，ELISA方法在临床中应用较为广泛。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测快速等优点，可适用于多种样品的检测，既可用于检测鸡群中的ALV-J抗原，又可用于检测ALV-J抗体，目前在实际应用中抗原检测较抗体检测要广。国外最早建立该方法，1979年，Simith成功建立了ELISA法70。当前，我国虽然有很多关于该方法的研究，但都未达到很好的效果，主要还是依赖进口。ELISA法无法区分内源性病毒和外源性病毒，检测结果有出现假阳性的可能。但该方法速度较快，对于大型鸡群的常规检测很有适用性。除利用ELISA检测外，还可通过其他一些方法检测。IFA虽然敏感性很高，特异性强，可快速作出诊断，但多用于实验室诊断，很难在生产上推广使用；病毒中和试验敏感性最高且具特异性，但操作繁琐，耗时长，在诊断中很少应用；琼脂扩散试验方便易行，适用性好，但该方法容易使鸡产生应激反应，敏感性差，易出现假阳性，实际操作起来很困难。3.5.3 分子生物学检测方法目前，ALV-J病毒检测的方法主要是PCR技术。该方法检测ALV-J具有特异性高、快速简便等特点，其敏感性是ELISA检测方法的5倍以上。被检样品的DNA可以从细胞培养物上提取，也可以直接从患病鸡的肝脏、血液等组织提取，用以检测ALV-J的前病毒DNA67。但该方法对仪器和操作要求较高，适用于实验室检测。3.6 防治本病的传播方式有垂直传播和水平传播，但主要为垂直传播，产生免疫耐受的鸡，成为主要的传染源，本病通过疫苗免疫后未产生明显效果，且至今尚无有效的疫苗，防治本病最有效的措施为净化种鸡群。从种鸡群消灭ALV-J的步骤包括：选择蛋清和泄殖腔棉拭子检测呈阴性母鸡的受精蛋进行孵化；淘汰胎粪检测ALV-J呈阳性的雏鸡，并同时淘汰其家系成员；在隔离条件下饲养无ALV-J的各组鸡，连续进行4代，建立无ALV-J替代群。但该方法难度大，可行性较差，目前最有效措施主要是减少母源性感染，另外严格的消毒措施也可避免雏鸡的感染。4 鸡白痢鸡白痢（PD）是由鸡白痢沙门氏菌（SP）造成的，严重影响了养鸡业的发展71。并通过多种途径传染给人，对人类健康造成严重威胁72。该病一直是养鸡业的顽疾，对雏鸡危害最大，感染鸡可大量死亡73；成年鸡多为隐性感染，并可将病菌传给子代。该病在1899第一次被报道，1929将被正式命名为“鸡白痢”，而且至今仍在使用。在近几年，该病的发病特征发生变化，如疫病混合感染愈加严重、疫病的非典型性增多、饲料质量致病因增多、遗传病因致死率明显增高等变化74，成为新的防治重点之一。4.1 病原学鸡白痢沙门氏菌（SP）为肠杆菌科沙门氏菌属，因其无鞭毛而不运动，无荚膜，不产生芽胞。革兰氏染色阴性，细菌的两端钝圆，大部分是以单一的形式存在。革兰氏染色阴性，细菌的两端钝圆，呈直杆状，绝大多数菌体以单个形式存在。在伊红美蓝培养基上生长为有特征性的小菌落12。在肉汤琼脂培养基上生长较差，菌落较小。通过SS选择培养基培养有明显的特征 75。SP有O抗原，无H抗原。O抗原成分分别为1、9、12，其中O抗原12具有变异性（O抗原121、122、123）76。该菌能使鸟氨酸发生脱羧反应77,78。本菌对热和常规消毒剂较敏感，加热至70 经过20 min，用消毒剂经1520 min均可将其杀死。但该菌对外界自然环境具有较强的抵抗力，存活时间较长。4.2 流行病学在禽类中，鸡表现出较强的易感性，火鸡也可感染78,80,81。不同品种的鸡对鸡白痢沙门氏菌的易感性不同82。母鸡较公鸡易感本病，病鸡、带菌鸡可成为传染源。该病可通过垂直和水平两种方式传播。水平传播主要是在鸡群内和鸡群之间及养殖场间的传播，病鸡的粪便污染了饲料、饮水、用具，健康鸡通过接触经消化道感染。本病主要通过垂直传播，带菌母鸡可通过卵将病菌传给子代。带菌卵孵化出的病雏能将大量病菌排出体外，健康雏鸡可通过接触而受到感染。健康雏鸡受感染后，未及时采取有效措施，可发生死亡，耐过鸡则成为带菌者，成年后可通过卵传给子代。本病常年都有发生，管理、环境、应激等因素可促进本病的发生。4.3 临诊症状及病理变化该病的发病症状在雏鸡和成年鸡中明显不同 83。雏鸡感染后的潜伏期为45 d，大多在孵化出几天后才表现出明显症状。一周后发病鸡数量逐步增加，在随后的一至两周数量最多。病鸡有的急性死亡，有的表现精神萎靡，羽毛松乱，翅膀下垂等症状。在初期病鸡的采食量下降，随后无采食行为。发生腹泻的病雏，有时可因粪便风干堵塞肛门，从而引发炎症。对本病耐过的鸡可变为带菌鸡，发生感染的成年鸡症状不明显。母鸡发生感染后，其生产性能明显下降，有的还可发生急性死亡。发生急性死亡的鸡，未表现出明显的病变特征。病程较长的，通过剖检后在心肌、肺、肝、盲肠、大肠等处可见坏死灶或结节。输尿管膨胀，盲肠发生阻塞，且有时混有血液。肺部常因炎症发生病变。育成鸡发病后，肝脏明显肿大，颜色呈暗红，在肝表面有坏死病变，在其内部发生出血，有大量血水积聚腹腔内，在肝表面可见有大的凝血块。成年鸡感染后主要表现为生殖器官产生病变。4.4 危害鸡白痢沙门氏菌主要有两方面的危害：一是会导致鸡生长缓慢，感染鸡后，为了抵抗菌体内增殖需要消耗大量的能量，从而增加养殖成本；二是可造成鸡的生产性能明显降低。有试验表明，发生感染的母鸡所产蛋的蛋品质下降，且阳性母鸡子代雏鸡较阴性母鸡更易发生死亡84。时倩等的试验显示鸡白痢阳性鸡群的生产性能较阴性鸡群的低85。张丹俊等研究发现，在经过鸡白痢净化后，鸡的死淘率发生明显的下降；且净化组在蛋重、料蛋比、种蛋受精率等方面均优于非净化组86。4.5 诊断和检测鸡白痢可根据流行病学、临诊症状和病理变化进行初步诊断，进一步确诊还应进行细菌的分离和鉴定。此外还可应用血清学方法和分子生物学方法。4.5.1 细菌的分离和鉴定通过无菌操作采集适量病死雏鸡的肝脏、心血、卵黄、胆汁、脾脏等器官或组织，捣碎后接种到SS琼脂或麦康凯琼脂培养皿上，37 下培养24 h，观察菌落形态。若出现圆形细小无色透明的光滑菌落，可以判定为可疑菌落，革兰氏染色作形态学检查，之后可进行血清学鉴定。4.5.2 凝集试验法鸡白痢免疫耐受鸡的血液中可产生特异凝集素，因此可采用凝集试验法诊断是鸡白痢。Runnels87先用玻璃平板凝集试验对鸡白痢沙门氏菌进行了检测。随后，有关人员提出了相应的改进，使该方法更为方便，快捷。血清、全血、卵黄等可作为检测材料。全血平板凝集试验具有操作简单、反应速度快的特点，因而被广泛用于生产中，但由于受各种客观条件影响，检测结果会有一些假阳性。另外，该方式灵敏度低，有漏检的可能。由于血清中含有高水平的抗体，因此血清平板凝集试验具有更高的灵敏度和更强的特异性，但由于该方法操作较复杂，因此适用于核心鸡群净化检疫87,89。间接血凝试验的阳性检出率比全血平板凝集试验要高10%30%，且在l2 min即可判定结果，是一种检测鸡白痢的新方法90。4.5.3 ELISA方法ELISA法在鸡白痢沙门氏菌的检测中应用较为广泛。在检测雏鸡时采用全血，而在检测成年鸡时，既可以采用血清，也可采用全血，二者检测的抗体水平比较接近91。ELISA方法具有灵敏度高、检测速度快的优点，但是该方法特异性较低，且仅采用ELISA法检测可靠性不足，还应结合凝集试验等。4.5.4 PCR方法随着分子生物学检测技术的发展，一些先进的检测技术开始被广泛应用。抗生素的滥用造成该菌产生耐药性，因此分离该菌较困难，且常规检测方法的结果准确度不高，PCR成为检测该菌的一个新的有效方法，该方法通过提取病鸡组织中的DNA，并从其中扩增了一个片段，长度为284bp，利用inva基因中的定向序列合成所需的引物。该方法对于从阳性鸡和阴性鸡中分离到的细菌DNA，均可将其检出，且较一般方法的敏感性高，是一种更有效果的检测方法92。4.6 防治4.6.1 预防措施建立无感染鸡群：主要是净化种鸡群，应选用健康种鸡，保证种源的健康性。经过检测后，对阳性鸡和可疑鸡进行淘汰，检测每年都应进行，每次检出阳性鸡且经确诊后，采取净化措施，直至淘汰全部阳性鸡和可疑鸡。规范饲养管理技术：在每次进鸡前都要至少提前2周对鸡舍、设备、用具及周围环境进行彻底消毒。在饲养过程中，制定合理的日粮配方，执行严格的消毒措施，做好育雏工作。在孵化种蛋前要做好清洗和消毒工作，用作孵化的种蛋应产自无病种鸡，且种蛋须经消毒后才可入孵。雏鸡出壳后可在饮水或饲料中添加适量抗生素，但应合理选择与使用药物，避免产生耐药性。4.6.2 治疗抗生素治疗：在利用抗生素治疗本病前，最好先利用现场分离的菌株要做药敏试验93。磺胺类药物在治疗本病时效果较好，可作为首选药物。此外，土霉素、环丙沙星、恩诺沙星、卡那霉素等也有较好的疗效。中药治疗：随着鸡白痢沙门氏菌的耐药性增强，家禽产品中的抗生素残留量也随之增加，对消费者的健康构成了严重威胁。中草药由于药物残留量低，而且可以增强机体的免疫力，现已广泛应用于鸡白痢的治疗93。微生物制剂：微生物制剂是当前研究的热点，其中益生菌的应用对鸡白痢沙门氏菌起到了积极作用。益生菌通过改善动物胃肠道内的菌群，进而起到预防和治疗致病菌感染的作用。对新生雏鸡使用益生菌可有效控制沙门氏菌。常用的益生菌有乳酸菌、双歧杆菌等，对治疗该病效果较好，且环保无污染，有很好的应用前景94。引言黄山黑鸡在品种分类中为兼用型，为安徽省特有的家禽品种。该品种具有全身黑羽，适应性强，体型清秀，肉蛋品质高等特点，2009年通过我国有关部门的专业鉴定95。鸡白血病是严重危害鸡群的最重要的疾病之一，主要是经种蛋垂直传播，国内外防制鸡白血病主要通过检测种鸡ALV阳性率，淘汰带毒的种鸡，切断其传播途径96。鸡白痢也是影响我国养鸡生产的重要疾病，与鸡白血病均可通过种蛋垂直传播。受污染的健康母鸡所产种蛋和带菌母鸡产的种蛋在孵化时，会有死胚或病雏，成为健康雏鸡的传染源，经感染且耐过的可成为带菌鸡，经带菌卵传给子代，形成恶性循环，可造成严重的危害97。当前，地方鸡规模化饲养条件下白血病、沙门氏菌病的净化引起业界关注，同时地方鸡不同饲养模式对主要垂直传播疾病阳性率的影响研究较少。本研究通过比较笼养和放养两种饲养模式对地方品种黄山黑鸡白血病、鸡白痢阳性率和繁殖性能影响的差异，为黄山黑鸡种源性疾病净化与防控提供参考依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物试验黄山黑鸡选自安徽省黄山市黟县柯村黄山黑鸡保种场