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蛋白质的结构与功能一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein一、组成蛋白质的元素及特点 蛋白质元素组成的特点由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：二、蛋白质的基本组成单位氨基酸存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸仅有20种。氨基酸的其它分类*芳香族氨基酸：苯丙、色、酪脂肪族氨基酸：丙、缬、亮、异亮含硫氨基酸： 蛋、半胱含羟基氨基酸：丝、苏、酪另外：1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修 饰的修饰氨基酸 如：脯氨酸 羟基化 成 羟脯氨酸 赖氨酸 羟基化 成 羟赖氨酸2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在五、氨基酸之间的连接方式1）连接方式：肽键肽键(peptide bond)：是由一个氨基酸的a-羧基与另一个氨基酸的a-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。氨基酸残基(residue) :肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。六、重要的生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)七、蛋白质的分类 蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein三、蛋白质的三级结构对于单一多肽链的蛋白质，三级结构是它的最高级结构，只有具有完整的三级结构，才具有全部的生物学功能思考：1）含酸性氨基酸较多的蛋白质其等电点 是偏酸还是偏碱？ 2）等电点为6的蛋白质于8.6的缓冲溶 液中，其于电场中向何方向移动？应用：电泳、离子交换层析分离蛋白质）性质改变： 生物学活性丧失 溶解度下降 粘度增加 易被蛋白酶水解、蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 附：蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同 什么是蛋白质组？对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 主要研究内容 附：蛋白质印迹 (Western Blot) 蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。 2、电泳（Electrophoresis）： 一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。 蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。目前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。(3) 封闭(Blocking)：封闭可能结合非相关蛋白的位点。现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛奶中可能含有要用Western印迹法检测的蛋白质时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。5、二抗孵育 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或放射性核素标记的二抗与之反应。 二抗需根据一抗进行选择。6、显色： 用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。Western Blotting实验流程第 三 章 核酸的结构与功能 概述： 1、核酸的发现及命名 核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA）的通称 2、核酸的分类、分布及生理功用 分 类 主要分布 主要生理功用 DNA 细胞核 遗传信息的载体 RNA 细胞质 参与蛋白质的生物合成 3、核酸的水解小结：DNA、RNA基本组成的异同* 戊 糖 碱 基 磷酸 DNA 脱氧核糖 A、G、C、T 磷酸 RNA 核 糖 A、G、C、U 磷酸 3、核苷（nucleoside) 1）核苷的定义：碱基与戊糖通过糖苷键相连而成的化合物。 2）碱基与戊糖的连接部位： 4、核苷酸(nucleotide) 1）定义：核苷与磷酸通过酯键相连而成的化 合物 2）连接部位：戊糖的第五位碳上的羟基磷 酸化 3）分类：核糖核苷酸 脱氧核糖核苷酸 注：一磷酸核苷 monophosphate (MP) 二磷酸核苷 diphosphate (DP) 三磷酸核苷 triphosphate (TP)核苷酸的结构 三、核酸的一级结构 1、定义：组成 DNA（或RNA）的脱氧核苷酸 （或核苷酸）的排列顺序 2、连接键：35- 磷酸二酯键 （多核苷酸链的方向：53） 3、表达方式：结构式 线条式 文字式 第二节 DNA的空间结构与功能 一、DNA碱基组成的特点 1、A+T/G+C的比值有物种特异性，且物种 亲缘关系越远，差异越大； 2、无组织器官特异性: 不同组织器官中 的DNA碱基组成相同，而且不因年龄、 环境及营养变化而改变； 3、组成的规律性：DNA分子中四种碱基的 摩尔百分比，即A=T、G=C、A+G=T+C人类的遗传物质是DNA，它的总和就是人类基因组，由大约30亿碱基对组成，分布在细胞核的23对染色体中。“人类基因组计划”的核心，就是测定人类基因组的全部DNA序列转录组学（transcriptomics） 1.转录组:是指转录后的所有mRNA的总称。 2.研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的 类型与拷贝数。 3.与基因组不同的是，转录组的定义中包含 了时间和空间的限定。 主要RNA的分类及功用 分 类 主要功用 mRNA 蛋白质生物合成的模板 tRNA 氨基酸的搬运工具 rRNA 与蛋白结合成核蛋白体，为 蛋白质生物合成提供场所 RNA的总体结构特点： 以单链形式存在；局部可形成双螺旋；碱基组成比例无规律性 真核生物mRNA的结构特点： 1）mRNA含量少、更新快、分子大小不一 2) mRNA可形成局部双螺旋结构的二级结构。 3) mRNA在真核生物中的初级产物称为HnRNA 4) 5-端有7-甲基鸟苷三磷酸(m7GTP)的帽子 结构 5) 3-端有多聚腺苷酸(PolyA)尾巴结构 二、tRNA的结构特点： 1) 分子最小；大小均一；含有稀有碱基最多 2) 局部双链形成茎-环样结构/发夹结构 3) 二级结构：呈“三叶草”型。 包括：氨基酸臂、DHU环、反密码环、附 加环、 TC环等 4）三级结构：倒“L”型 rRNA的结构特点： 1）rRNA是含量最多的RNA，占总量的80。 2）rRNA与蛋白质构成核蛋白体 （由大、小亚基组成） 原核生物：5S, 16S, 23S 小亚基含：16S 大亚基含：5S和23S 真核生物：5S，5.8S，18S，28S 小亚基含：18S 大亚基含：5.8S，5S，28S 第四节 核酸的理化性质、 变性和复性及其应用 一、核酸的一般理化性质 （一）为两性电解质；呈酸性；分子大， 粘度高 （二）紫外吸收特性： 1、最大紫外吸收峰：260nm 2、产生原因：碱基中的共扼双键 3、应用：定量分析；鉴定纯度 三、核酸变性（DNA变性） 1、定义：在理化因素作用下，DNA双螺旋 的两条互补链松散而分开变成单链的过程。 2、变性的因素：高温（常用） 强酸、强碱 有机溶剂等 3、变性的实质：氢键断裂（磷酸二酯键完好） 4、主要性质改变： 1 )紫外吸收值增加-增色效应 增色效应:指DNA变性后对260nm紫 外光的光吸收度增加的现象。 2 )旋光性下降 3 ) 粘度降低 4 ) 原有生物功能部分或全部丧失 DNA的变性与复性 七、核酸杂交(hybridization) 1、具有一定互补序列的多核苷酸链按 碱基配对规则结合成异质双链的过程。 2、结构基础：有互补序列 3、分类： DNA-核酸探针 Southern杂交 待测者 RNA-核酸探针Northern杂交 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 核酸分子杂交: 固相杂交 (印迹杂交,原位杂交) 液相杂交 第五节 核酸酶（简介） 一、定义：所有可以水解核酸的酶 二、化学本质：蛋白质 三、分类 1、按作用底物分：DNA酶(DNase) RNA酶(RNase) 2、按作用部位分：核酸外切酶 核酸内切酶 四、核酶 1、定义：具有催化活性的一类核酸分子 2、化学本质：RNA（主要） DNA 有的核酶具有核酸内切酶活性DNA的合成反应包括: 1.DNA指导的DNA合成(复制) 2.RNA指导的DNA合成(逆转录) 3.修复合成复制的方式半保留复制 (semi-conservative replication)半不连续复制 (semi-discontinuous replication) 双向复制 (bidirectional replication)复制的高保真性 （high fidelity） 一、半保留复制 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。这种复制方式称为半保留复制。二、半不连续复制三、双向复制(bidirectional replication)复制开始时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 原核生物： 基因组是环状DNA 只有一个复制起始点 真核生物： 染色体DNA有多个复制起始点。 两个起始点之间的DNA片段称为复制 子(replicon)。 复制子是独立完成复制的功能单位。参与复制的主要酶类 一、DNA聚合酶* 二、解链、解旋酶类 解螺旋酶 DNA拓扑异构酶 单链DNA结合蛋白 三、引物酶 四、DNA连接酶DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-polDNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读1.DNA聚合酶I (DNA-pol I)单肽链（109kD）含量最多,具有DNA聚合酶的三种酶活性.用特异的蛋白酶处理后可水解成两个片段: 小片段(N端) 大片段(C端)作用: 53外切酶：去除RNA引物 35外切酶:切除错配碱基，起校正作用 53聚合酶活性：填补两个冈崎片段之间的缺口二、解螺旋酶(Dna B)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链五、引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶作用*: 为DNA-pol发挥作用提供的3-OH 一、原核生物的DNA生物合成DNA复制分为三个阶段复制的起始复制的延长复制的终止复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点,常用ori或o表示。DnaA、B、C三种蛋白质共同参与 DnaA蛋白：辨认复制起始点 DnaB蛋白(解螺旋酶)：解开DNA双链 DnaC蛋白：运送和协同DnaB复制时双链打开成两股单链，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种Y字形结构称为复制叉（replication fork）单链DNA结合蛋白（SSB）与解开的单链结合，保持DNA模板的单链状态。 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶的催化下，进行延长反应。四、真核生物的端粒和端粒酶 （一）端粒 1、端粒：是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 2、作用：维持染色体的稳定性-防止融合或降解，保证DNA复制的完整性 3、结构特点：富含G、T的短重复序列，染色 体末端膨大呈粒状。（自带模板的逆转录酶*）1、组成： RNA-蛋白质复合体 2 、作用 : 模板 逆转录酶活性端粒酶的爬行模型（动画演示）复制过程小结 特定起点、双向伸展 解旋解链、引物当先 单向延伸、由5，到3， 分段合成、切除引物 校对修补、连接成熟碱基替换后可能的后果* 1.同义突变 基因改变,编码的氨基酸未改变 2.错义突变 基因改变,编码的氨基酸也改变 3.无义突变 基因改变,导致编码密码子变成终止密码子 4.通读突变 基因改变,导致终止密码子变成编码密码子 一、错配修复（mismatch repair） 一种纠正复制后子链中错配碱基的修复方式。 1、与错配修复有关的蛋白和酶 MutS蛋白