蛋白质工程原理与技术.doc

蛋白质工程与原理技术1、什么是蛋白质工程？ P1答：蛋白质工程（Protein engineering ）是通过对蛋白质结构与功能关系的了解，借助于生物信息学的知识和手段，利用基因定点诱变和基因重组等技术特异性地改造蛋白质的结构基因，产生具有新的特性的蛋白质的技术。 2、什么是基因定点诱变？ 答：就是在DNA水平上，通过对蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。该技术不仅可用于改造天然蛋自质，而且可以用于确定蛋白质中每一个氨基酸在结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸线形顺序与其空间构象和生物学活性之间的对应关系，为人工改造蛋白质提供理论依据。3、什么是表达载体？ P27答：表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（转录和翻译所必需的DNA序列，如启动子、终止子等），使外源DNA片段能够在宿主细胞中表达蛋白质。包括原核细胞表达载体和哺乳动物细胞表达载体两类。 4、什么是克隆载体？ P27答：克隆载体：在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并引入到宿主细胞中进行大量繁殖，使外源DNA片段得到大量扩增。5、基因克隆的基本程序？ P29答：（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细 胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。6、真核基因在大肠杆菌中的表达方式？（条件）P34答：基本条件：大肠杆菌没有剪切内含子的功能，所以，真核细胞的目的基因必须来自于cDNA;真核基因mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列，因此cDNA的起始密码子(ATG)上游部分(5端非编码区)是无用的，必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去 信号肽部分；表达载体应是含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子和SD序列的大肠杆菌表达载体;载体上只能用大肠杆菌启动子，将外源基因克隆在启动子下游，以便大肠杆菌RNA聚合酶识别启动子，并带动真核基因在大肠杆菌细胞中转录。目前，商用表达载体都含有启动子和SD序列，无需自己构建，只要选择合适的载体即可;为提高表达效率，应根据启动子类型和特定的蛋白质，选择合适的菌株和诱导条件。表达方式：真核基因在E. coli中可以表达为：融合蛋白：融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。表达融合蛋白的必要条件是条件：将真核基因连接在一段原核基因的下游后，真核基因的读码框架必须与原核基因的读码框架相符合。非融合蛋白：非融合蛋白是指在细菌内表达的蛋白以真核蛋白mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。为此，表达非融合蛋白的操纵子须改建成：原核启动子一原核SD序列一真核基因的起始密码子、结构基因及终止密码子。分泌型蛋白：将真核基因重组于编码原核蛋白信号肽序列的下游，以表达带有原核蛋白信号肽的融合蛋白。这种融合蛋白当分泌到位于E. coli细胞内膜与外模之间的周质时，其信号肽可被信号肽酶切割，而真核蛋白分泌至胞外。信号肽最终被水解。7、什么M13是寡核苷酸定点诱变？ P37答：按照体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13单链DNA，即正链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。8、什么是PCR定点诱变？ P40答：将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中;在每一个反应管中加人两种特定的引物，其中引物1和3均含有错配核苷酸、但两个引物分别与质粒DNA的不同链不完全互补，引物2和4均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒DNA的引物1和2杂交链的互补链完全互补;进行PCR扩增获得含有突变碱基的线型质粒DNA;将两个反应管中的线型质粒DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有切口的环状DNA分子;转化入E.coli，环状DNA分子的切口可被E.coli修复。 9、什么是盒式诱变（cassette mutagenesis） P40答：盒式诱变（Cassette mutagenesis）利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列。10、二硫键与蛋白质稳定性及活性的关系？ P42 答：加入二硫键 二硫键（-s-s-）的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。 在有活性的酶中，打算改变成半胱氨酸残基的氨基酸在空间上要相互靠近。这种空间上的邻近能确保整个分子构型将会基本上不受新的二硫键连接形成的影响。目标氨基酸和酶的活性位点没有关系。 减少游离Cys残基的数目 在利用DNA重组技术表达外源基因中，常常会遇到外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，这很可能是由于在宿主细胞内，外源蛋白的错误折叠所致，利用蛋白质工程技术可以减少游离的半胱氨酸( Cys)残基数目，减少蛋白错误折叠的可能性，从而提高蛋白质的生物活性。将Asn和Gln转换成其他氨基酸 当蛋白质暴露于高温时，天冬酰胺(Asn)和谷氨酞胺(Gln）残基可能发生脱氨，这个反应释放出氨。随着酰胺部分地丧失，这些氨基酸分别变成了天冬氨酸和谷氨酸。肽链折叠的局部的改变可能会随之导致活性的丧失。11、什么是酶的定向进化？定向进化的作用？ P61 P63答：酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）是改造蛋白质分子的一种新策略。它不需要事先了解酶的定向结构与催化机制，在实验室模拟自然进化机制，通过由易错PCR、致突变菌株诱变等方法对编码酶蛋白质的基因进行随机诱变，由DNA改组、随机引发重组和交错延伸等方法进行突变基因体外重组，设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。定向进化就是随机突变加定向选择。 定向突变的作用：提高酶活性 改变底物特异性 改善酶的稳定性 获取具有新功能的酶 提高药用蛋白和疫苗的活性 改善整个代谢途径12、什么是人-鼠嵌合抗体？ P74答：人-鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。人-鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，它完整地保留了亲本鼠单抗的特异性和亲和力，同时大大降低了免疫原性，利于在人体内应用。目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体13、什么是人改型抗体？ P74答：抗体的可变区有六个CDR（抗原结合位点）区，直接与抗原接触，决定了抗体的特异性，其余部分只是作为支架，且结构极其保守。因此，可将鼠单抗的CDR移植到人单抗骨架区，使人单抗获得鼠单抗的特异性，并极大地减少了鼠单抗的异源性。这种技术所得到的抗体称改型抗体，或CDR移植抗体。14、如何获得稳定的小分子抗体Fv段？ P76答：Fv段是抗体分子中保留抗原结合部位的最小的功能片段，它是由轻链可变区和重链可变区组成。二者通过非共价键结合在一起。因此，在浓度较低时有解离的倾向，因而极不稳定。因此欲获得稳定的Fv段，需设法将两个可变区连接起来，目前有三种途径:通过化学方法用戊二醛使两个可变区交联，选择适当的部位通过点突变引人半胧氨酸残基，使轻链和重链可变区之间形成链间二硫键;在DNA水平上将轻链和重链用一段适当的寡聚核苷酸(接头)连起来，使轻链和重链表达成一条单一的肽链，称为单链抗体(single chain Fv, ScFv)，它更易于在原核细胞进行表达和在基因水平进行改造。 15、什么是抗体库？ P80答：抗体库：利用基因工程技术克隆全套人抗体重链和轻链可变区基因，并在大肠杆菌直接表达和分泌，利用不同的抗原筛选出特异性抗体，所获得的抗体库称为全套抗体库(repertorie antibody library),又称为组合抗体库(combinatorial antibody library).16、激素类及细胞因子类基因工程药物有哪些？ P86答：细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、促红细胞生成素(Epo)、趋化因子、生长因子、凝血因子。蛋白类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体型其他：血红蛋白、白蛋白等。17、什么是Edman降解法？ P129答：Edman降解法迄今仍然是蛋白质或多肽顺序测定技术中最有效和最基本的方法。是1950年由Edman首先提出并以他的名字命名的一种化学降解法。降解所用的试剂是异硫氰酸苯酯（PITC），它与蛋白质或多肽的自由a-氨基作用。逐个水解N端氨基酸残疾一次生成各种PTH-氨基酸。层析鉴定PTH-氨基酸就可以C、N端逐个确定被测肽段的氨基酸顺序。18、什么是肽指纹图谱？ P139答：肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting,PMF）是对蛋白质酶解或降解后所得到多肽混合物进行质谱分析的方法，对质谱分析所得肽片与多肽蛋白质数据库中蛋白质的理论片段进行比较，从而判别所测得蛋白是已知还是未知。19、生物质谱在蛋白质和多肽的结构测定中的应用？ P139P141答：分子量测定 肽谱测定 肽、蛋白质序列测定技术 巯基和二硫键定位 蛋白质翻译后修饰 生物分子相互作用及非共价键复合物 蛋白质组研究20、X-射线晶体衍射技术在蛋白质晶体结构测定中的应用？ P142答：X-射线晶体衍射法是测定蛋白质晶体结构的及其重要的方法。分析晶体衍射图就可以确定晶体内部的原子（或分子）间的距离和排列。21、核磁共振波谱技术？ P144答：核磁共振是研究原子核在磁场中吸收一定频率的辐射能量进而发生能级跃迁现象的一种波谱法。人们以从核磁共振波谱上获得很多的信息。核磁共振波谱可以提供分子中化学官