重楼的组织培养.doc

重楼的组织培养1.外植体的选择与消毒1.1外植体的选择据李群等对重楼组织培养外植体有4个取材时期，即萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期，子房取自花冠露白期，叶片取自萌芽和展叶期，幼芽取自萌芽期、展叶期、倒苗期，试验结果表明，其中以展叶期旺盛生长的根茎作外植体，其愈伤组织的诱导频率最高，达16.6%，萌芽期取材次之，在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导产生愈伤组织。根和叶片既不能诱导出愈伤，也不能诱导出小球茎，接种后很少启动，污染也较少，大约2个月后干枯死亡。而根茎、子房、幼芽都能不同程度地诱导出愈伤组织，特别是幼芽，不但诱导出的愈伤组织块数最多，诱导频率最高，达68. 25%，且还能诱导出小球茎。可见，不同的外植体的诱导频率差异很大。在四川峨眉山海拔2000 m左右的环境下，重楼属植物的生长期一般为4月至5月中下旬，大约二个月左右的时间。因此，取材时间应在4月至5月上旬这段时间。但在这段时间取材培养，会发现外植体极易污染。必须采取一些措施减轻或控制外植体的污染。.1.2外植体的消毒接种前置于18 e 弱光下保存，一般滞留2-4d即接种培养。取重楼的芽，自来水冲洗2-3h，去除表层的芽鞘，再用自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗3遍。在无菌条件下，用75酒精消毒30S，无菌水冲洗3-5次，0.1升汞灭菌15min，无菌水冲洗5-8次。将芽外部的芽鞘按层剥下，切成长宽分别为1cm 左右的小块，芽内部不能分层的部分按切外层芽鞘的大小切成小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，一般幼嫩的芽和叶片灭菌3-4min；根茎灭菌10min，子房和根灭菌6-8min。灭菌以后的材料用无菌水清洗3-5次，最后接种于培养基（1）上，置于（202 )培养温度，光照时间8h/d的条件下培养。培养基：（1）MS+BA 1.0 +IAA 2.0 和 MS+BA 2.0 +IAA 1.0 培养基上，不但能诱导愈伤组织，还能诱导出小球茎。2.愈伤组织的形成 在上述培养基中，形成的愈伤组织增殖较慢，但愈伤组织的质地较坚硬，呈淡黄色，有较好的保持潜力，从外植体来看，幼芽基部形成的愈伤组织增殖较快，愈伤组织呈颗粒状，较易分散，根茎形成的愈伤组织质地较疏松，时间长了以后，愈伤组织易纤维化，失去增殖能力，子房形成的愈伤组织也较疏松，且易褐变。芽组织切块接种到愈伤组织。25d后，接种切块开始膨大；再过15d左右，接种块切口处逐步形成淡黄色表面粗糙突起质地较坚硬的愈伤组织。3.愈伤组织的增值与分化 增值与分化培养基：（2）MS+6-BA2 +NAA0.5 +KT0.5把诱导出愈伤组织的切块转接到培养基（2）上，愈伤组织开始缓慢增殖：90d后再转接到新的培养基（2）上；经过约180d，增殖到直径约0.5cm的愈伤组织块由淡黄色逐步变为白色，表面由粗糙突起逐步变为平滑：再过30d后，逐步分化形成一个芽。分化出的芽如果不进行生根诱导，在培养基（2）上继续生长150d左右可展叶形成完整的无根苗，210240d为一个增殖周期，每个周期可繁殖不定芽1-2倍。4.诱导生根生根培养基：（3）1/2MS+NAA0.5 +IAA0.5将分化出的芽切下，接种于培养基（3）上进行根的诱导。在培养过程中芽的基部逐步褐化伸长成根茎状，培养60d左右，在褐化伸长前端芽的基部可长出2-3条根，生根率为76.3。5.结论5.1据报道（李群、张丽琼），利用组织培养来繁殖重楼的难度很大，只有芽段可成功诱导出植株，而茎尖的诱导虽然启动，但效率较低，尤其是不含皂甙成分，根茎、子房虽可诱导愈伤组织，但愈伤组织的增殖受到极大限制，而重楼其他外植体(如：根、叶片等)的组培技术到目前为止还没有成功的报道。利用幼芽诱导的愈伤组织生长缓慢，并有的不含原植物中的甾体。5.2重楼愈伤组织的诱导周期太长，采用芽诱导是可以诱导出小块茎，但这方面的未见报道。我们可以从这个方面着手，即外植体幼芽小块茎芽小苗。5.3据报道，重楼愈伤组织有的不含甾体，是指某一阶段不含，还是从愈伤组织到芽都不含，这目前还未见相关报道，但，我们在实验过程中可以分阶段来测定其含量。 5.4在重楼我们可以通过细胞悬浮培养等方法是否会提高其含量。5.4.1重楼愈伤组织悬浮培养体系的建立将得到的愈伤组织称取2g接种于含100ml的培养液中的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25，光照12h，每培养7-10天更换一次培养基，继代3-4次后逐渐形成稳定且大小均一的颗粒状细胞团悬浮培养体系。最后进行含量测定。5.4.2重楼小球茎悬浮体系的建立将组培中得到的小球茎称取3g接种于1/2MS+0.6 mg/LABA中，的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25，光照12h。观察其生长曲线，生长形态，并进行含量测定。但重楼的细胞悬浮培养未见相关报道，在这里我们参照半夏的细胞悬浮培养来进行实验，看是否可以成功。5.5重楼组织培养困难关键在于如何加快愈伤组织的诱导率、正确引导愈伤组织快速增值、目前重楼愈伤组织比较成功的是云南农业科学院高山植物经济植物研究所的杨丽云、陈翠等。重楼的内生真菌植物内生菌（Endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织或器官内部的真菌或细菌，宿主植物不表现出外在病害症状，可通过组织学方法将内生菌从植物组织中分离出来，或者通过从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。自从1993年美国蒙大拿州立大学的Stierle等从短叶红豆杉（Taxubrevifolia Nutt）的韧皮部分离到一株产抗肿瘤药物紫杉醇（Taxo1）的内生真菌安德鲁紫杉菌（taxomyces andreanae）以来，目前已经证明许多植物体内普遍存在着内生真菌，并且其能合成与寄主植物类似或相同的活性成分。通过内生菌大规模发酵培养生产活性物质被认为是最有前途的一种方法。培养基PDA：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂1520g、自来水1000ml、自然PH：1.内生真菌的分离取滇重楼根状茎用自来水洗净，在体积分数70%乙醇溶液中浸泡10S， 转入2gL的 HgC12溶液中消毒20min，无菌水冲洗3次，5min次 。用无菌刀片滇重楼根状茎切成5mm5mm5mm的小块，一部分直接摆放在培养基上，每皿放6块；另一部分研磨成汁，每皿，涂抹在培养基 面,置于25暗培养。37d后组织块边缘和涂布汁液培养基表面有真菌菌落长出，挑少许菌丝到PDA平板上反复进行纯化，然后转到含PDA的斜面试管中，用石蜡油封存。 2.内生真菌生物性状的观察 将所选择的真菌在PDA培养基上活化，在25下持续光照培养，5d后观察菌落和菌丝特征、是否产孢、孢子的形态等生物学性状。3.内生真菌的液体发酵培养和甾体化合物的提取 从斜面上挑取少许菌丝到PDA平板上活化3d，然后将活化的菌丝接种于培养瓶中，每瓶150mLPD培养基，每菌培养2瓶，共300mL培养液。在25，120rmin条件下培养 7d，过滤，收集滤液和菌丝。菌丝于50下干燥，滤液用正丁醇萃取3次。干燥的菌丝研磨后用正丁醇浸泡3次，24h次正丁醇萃取液和浸泡液合并。在50减压浓缩，称重，得发酵液中正丁醇提取物的产率（mgL）。4.甾体化合物的检测 4.1甾体化合物标准曲线 甾体化合物的检测采用Liebermann-Burehard显色反应，具体方法如下：准确称取薯蓣皂甙元标准品5mg，溶于10mL氯仿，配1.5mgmL溶液，倍比稀释成0.25，0.125，0.0625和0.03125mgmL系列浓度。各浓度标准溶液分别取3mL，加入2 mL显色剂，50水浴4 0mi n，冷却至室温，6h内测定460nm处的光吸收值，线性回归方程为Y=34965 X-0.0922(相关系数R-0.9959)。Y代表460nm处的光吸收值，X代表薯蓣皂甙元浓度( mg mL) 。 4.2甾体化合物的检测 准确称取一定量的提取物 (10mg)溶于3mL氯仿，采用Liebermann-Burchard显色反应，测定460nm处的光吸收值，根据线性回归方程计算甾体化合物在正丁醇提取物中的含量()，进而得出甾体化合物在发酵液中的产率(mgL)。 5.结果与讨论5.1 采用内生菌大规模发酵培养生产活性物质这个方法是可行的，目前在银杏、喜树、石斛短叶紫杉等方面均有报道。5.2采用内生真菌发酵获得甾体化合物其含量（可达208.62mgL）比栽培品中重楼皂苷含量要高53.42mg/g。5.3植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性物质，这样我们就可以通过内生真菌发酵培养生产生物活性物质，这样就可以有效的解决珍稀濒危植物的问题。特别是在采用其他生物技术困难的条件下如重楼、千层塔等采用这种技术可以提高产量、缩短生产周期等。5.4但目前从重楼中分离内生真菌产皂苷技术的报道不多，宣群等从滇重楼中分离出无孢菌群菌株 LRF4 具有抑制白色念珠菌的作用，张晓洁等从华重楼中分离出真菌SNUF-1和放线菌SNUA-1和SNUA-2能分泌甾体皂苷或其他类似的化合物，曹晓冬等报道了从滇重楼根状茎中分离到133株内生真菌，对其中的能产生甾体皂苷的7株菌株其产生的甾体皂苷进行了含量测定，但含量差别较大。但未进一步分离鉴定。大花红景天1. 外植体的选择选用大花红景天的幼茎和叶片作为外植体，在超净工作台上先用70%的乙醇浸泡材料30 s，再用0.1%的HgCl2浸泡23 min 用无菌水冲洗35次，然后用无菌滤纸将外植体表面的水吸干，将其切成大小相近的小块(约1 cm的茎段、5 mm*mm的叶片) 。然后分别接种到加有不同浓度配比生长调节剂的培养基(1)、（2）上。幼茎培养基：（1）MS+ 6-BA 2.0 + NAA 0.2（2）MS+ KT 2.0+ IAA 2.0（3）MS+6-BA 2.5+ NAA 0.5叶片培养基：（4）MS+ 6-BA 3.0+ NAA 0.3 （5）1/2MS+6-BA 0.5 +NAA 3.0（6）MS+6-BA 2.0 + IAA 0.2培养条件：各种培养基的pH值均为5.8；光照1O-16hd，光照强度约为1500-2000Lx，结合自然光照8OOLx左右。2. 愈伤组织的诱导7 d 左右叶片和幼茎开始膨大，15 d左右诱导出愈伤组织，34周继代1次用幼叶作外植体诱导愈伤组织的诱导率可达到92% ，而幼茎作外植体的诱导率只有 20% 因此，幼叶是诱导愈伤组织较为理想的外植体1。在诱导愈伤组织时，采用培养基（5）诱导出的愈伤组织形成三种颜色，愈伤组织诱导率达70%。刚诱导的愈伤组织呈绿、黄、红三种颜色，逐渐稳定后成黄绿色4。3. 不定芽的形成与增殖上述培养基中，（1）、（4）、（5）诱导愈伤组织，其他培养基直接分化出芽。在培养基（1）、（4）、（5）中，将继代34次的愈伤组织转至培养基（7）上，10 d后愈伤组织长出许多绿色芽点。此时可以不断继代，使其增殖，扩大培养。2次继代后便可诱导出丛生芽，以30d为1个生长周期每100 mL三角瓶愈伤组织产生不定芽增殖数达5倍以上，待芽生长至23 cm 时，将其成簇地分离，继续继代扩繁培养。当幼苗长至47 cm 时将苗分成单株培养，约34周继代1次。在培养基（2）、（3）、（6）外植体直接分化出丛生芽，大花红景天的叶片最易诱导丛生芽，接种 1 周后叶片膨大增厚约 1 倍左右，随着培养时间增长，在叶片上、下表面及切口处均能产生丛生芽，叶片中、下部分化芽的能力比叶尖强。24周后叶片均能分化丛生芽，分化率达 100，平均每块外植体可分化丛生芽的数量为20个左右。幼茎、茎尖与花芽也可分化丛生芽，但其分化所需时间长，且分化率较低， 不宜作为快繁技术的外植体。生芽组织块可切割继代， 4 0 d增殖为 1：3。 培养基（7）MS+ 6-BA2.0 + IAA0.254.生根将长至5 cm以上的单株幼苗转至培养基（8）或（9）上进行生根培养，培养过程中需要不断观察 如发现苗的基部出现褐化，应及时继代转到新培养基上，20 d左右便可长出约3 cm微红色的根，平均每株生根6 条，根长至5 cm 长1。培养基（8）MS+IAA 1.0 （9）MS+ NAA 0.2 5驯化与移栽平均每株生根6条，根长至5 cm 长时揭盖，相同环境下炼苗57 d，取出后洗去根上的琼脂，移栽至蛭石和营养土(1：1)的基质上，保持充足的水分供应并遮荫，移栽成活率可达 80%1。6存在问题6.1 由于大花红景天的叶片含内生真菌，因此在外植体消毒过程中易造成污染，但叶片又是大花红景天组织培养最好的外植体，因此解决其污染问题是组织培养的一大难题3-4。6.2 不同的培养基对其诱导不一样，选择出最佳培养基只有经过今后实验区验证。6.3 在有些培养基中，诱导出的愈伤组织有绿色、黄色、红色等几种颜色，在不同培养基中是否最后都会转变成黄绿色。6.4 在不同培养基中，诱导不一样，有的直接诱导出芽，有的诱导出愈伤组织在形成芽，究竟应用哪种，要根据具体需要采用最佳实验方案。6.5 大花红景天的叶片中含有内生真菌，我们是否可以利用这一特征将其转化为有效中去，但这一利用目前尚未见报道。高山红景天1.外植体的选择高山红景天的外植体可选用种子、茎、叶、根、茎尖等做外植体用，但种子、茎和叶诱导愈伤组织的效果较好，以根和茎尖做外植体诱导愈伤组织的能力不如种子、茎和叶片4。材料清毒处理：将外植体在流水下冲洗1 h ，在无菌工作台上，用7 0的酒精浸泡30S，再用0.1的升汞溶液浸泡 810 min，无菌水冲洗5次。然后将其接种于培养基上。 培养基配方：MS+6-BA2.0 + NAA0.5培养条件：培养基pH值均为5.8，琼脂6gL，蔗糖25mg/l ，在1.2 kg/cm2 压力下灭菌20min，接种后置于培养温度( 222)，光照强度为10001500lx ，每天光照12h。 2.愈伤组织的形成在培养基中培养一段时间后，开始出现黄、红、绿等不同色泽 的愈伤组织，其中黄色与红色愈伤组织结构疏松，而绿色愈伤组织相对致密，且诱导率高达88.33， 其中绿色、黄色与红色愈伤组织分别占65.98、12. 67与9. 67。绿色的愈伤组织容易形成不定芽，黄色和红色不易形成不定芽5。3.不定芽的诱导以添加2.0 6-B A和0.5 NAA的MS培养基诱导产生的愈伤组织作为外植体， 以相同成分的培养基进行3次继代培养后，愈伤组织生长十分旺盛，此时将不同色泽的愈伤组织转移到不同的芽分化培养基上进行培养，结果表明黄色与红色的出芽率均极低，在不同芽分化培养基上平均每个外植体出芽数低于3个，而绿色的出芽率相对则要高得多；将绿色愈伤组织转至不同诱导培养基后，2周内愈伤组织体积显著增大，45周后形成丛生不定芽，部分产生白色不定根， 不同培养基对愈伤组织出芽率的影响如表2 所示， 在不添加6-B A和NAA的培养基上， 出芽外植体数目很少， 在附加 1.0 6- BA和 0.1 NAA或 2.0 6 -BA和0.2 NAA的MS培养基上，外植体出芽率均达到100；但在附加 1 6-BA和0 .1 mg/l NAA的MS培养基上， 平均每个外植体出芽数目较后者高得多。此后 ， 随着6-BA和NAA质量浓度的升高，出芽外植体比例明显降低， 平均每个外植体出芽数目很少。因此，附加 1.0 6-BA和0.1 NAA的MS培养基作为高山红景天诱芽培养基是较为适宜的。 4.继代培养将愈伤组织产生的丛芽分别接种到附1.0 6-BA和0.1mg/l NAA的MS培养基上，芽开始增殖，每30-60d继代1次，增殖46倍。分生芽逐渐形成独立小植株，部分丛芽可长出幼根。 5.生根切取高2-3cm的芽体，接种于1/2MS+0.5 IAA培养基上，5-7d即可产生根原基突起。10-15d后，根长5-6 cm，平均每株生根9条，生根率达100。6.移栽与驯化当小苗长到45cm时，可打开瓶盖，放入大棚或温室内炼苗，3-5天后将小苗从从瓶中取出，洗去根部琼脂，移栽到装有消毒的蛭石和珍珠岩的培养钵中，恒温、光照下培养。用薄膜盖好保持80%的湿度，5-7天后除去覆盖物，加入1/3菜园土，在散射光下继续练苗，叶片展开后定植于田间6。高山红景天的移栽成活率较低。7.存在问题7.1高山红景天用茎和叶片做外植体诱导愈伤组织效果均较好，用叶片更能诱导愈伤组织，但以茎诱导愈伤组织中红景天苷的含量最高、其次是种子、最低为叶片。7.2 种子、茎和叶片诱导愈伤组织效果均较好，但这三种诱导愈伤组织的时间长短、形态及形成不定芽的能力属于哪种更好还未见报道，这还需进一步研究，并取得最佳方案。7.3 对其培养条件，在组培的每个阶段是否一样还需进一步研究。7.4 在其外植体诱导愈伤组织阶段是否需进行一段时间黑暗培养更能促进愈伤组织的形成也需进一步研究。金铁锁1.外植体的选择将金铁锁的幼嫩茎段经自来水冲洗干净，用75%乙醇浸30s，0.1% HgC12 溶液浸泡 8 min，无菌水冲洗 4-5次，然后切成约 1 cm 的茎段（带1-2片叶) ，然后接种于培养基（1）、（2）中。培养基（1）：B5+6-BA 0.5 +IAA 0.5（2）：MS+6-BA1.0 +IAA 1.0培养条件：诱导和增殖培养基附加30 g/L 蔗糖、琼脂0.6 g/L、pH 5.75 ；生根培养基附加25g/L 蔗糖、琼脂 0.6g/L 、pH5.75，光照12h，温度24。2.愈伤组织的诱导自刚接种7天后茎段开始膨大，逐渐长出淡紫色颗粒状的愈伤组织1015 天后形成芽，24个芽聚生在一起形成芽丛 ，2025天后长成无根苗。3.不定芽的分化与增值待小芽长到1.5-2 cm时，切取芽、带芽茎段和愈伤组织分别接种于培养基（3）和（4）上。转接后，10d左右芽和带芽茎段形成芽丛，愈伤组织继续生长，20d左右分化出芽， 20d即可继代1次。培养基（3）：B5+6-BA 0.5 +IAA 0.5 +Kt 0.2 （4）：MS+ 6-BA 0.5+IAA 0.054.生根培养将无根苗从基部接种于培养基（5）、（6）中，10 d后开始生根，苗基部长出3-10条辐射状白色不定根,成为完整的再生植株。培养基（5）：B5+NAA 0.1和IBA 0.05（6）：MS+ NAA 1.55.移栽与驯化试管苗在移栽前搬至不能加温的玻璃房内，置于阴凉通风处并打开瓶盖炼苗3d后，取出洗净基部培养基，将苗放在1000倍多菌灵溶液中浸泡20min，然后移至用1%高锰酸钾溶液消过毒的腐殖土和椰子壳(粉碎状)中，用塑料膜保湿,并进行叶面喷雾。腐殖土中成活率为20%，椰子壳中成活率为65%。待小苗在基质中发出新叶和白色新根时,即可移植到花盆中，移栽成活率达到70%。千层塔4.1外植体的选择由于千层塔植株内含内生真菌（即枝状枝孢霉、黄青霉、尖孢镰刀菌和盾壳霉），所以在外植体灭菌时比较困难。 将千层塔茎尖首先用自来水冲洗，然后在加有洗涤剂的水中浸洗，最后用清水冲洗干净。灭菌时先在超净工作台上用 70 %酒精浸泡 1 min ,然后在不同的灭菌剂中灭菌。如采用20 %的次氯酸钠溶液灭菌 15 min 或在0. 1 %的升汞溶液灭菌 3 min，然后用无菌水冲洗4-5次，将外植体接种于培养基（1）或（2）中。培养2周内为出现污染或少量污染，在2周后陆续出现污染。在两周后挑出污染不太严重的外植体用同样方法在灭菌3-4次，这样灭菌成功率相对较高些，可达42%。培养基（1）：MSB+2.4-D 0.1 +TDZ 0.5 +6-BA 0.5 （2）MS+KT 1.0 +2.4-D 5.0培养条件：温度：24光照：暗培养4.2愈伤组织的诱导在接种到MSB培养基中的外植体，诱导出愈伤组织；在MS培养基中能诱导出愈伤组织，两个月后长褐色的愈伤组织，以后停止生长，约两个半月后长出淡黄色的愈伤组织，生长速度为每月加倍。将存活的外植体转接到培养基（3）中，2个月后可以诱导出褐色的愈伤组织，但诱导率不足1%。培养基（3）：SN6+2.4-D 5.04.3不定芽的产生与增值4.4生根4.5 移栽与驯化4.6,.遇到的问题4.6.1 采用上述方法灭菌，出现污染的外植体是什么菌种，外植体是否会出现白化，白化率有多高。4.6.2 是否可以利用抗生素达到降低污染率的问题。加抗生素来消毒千层塔1. 外植体消毒同前一样（茎尖）培养基：1/4MS矿质元素+1/2有机元素+2%蔗糖2. 内生真菌的消毒，参照Szypula的方法：经表面灭菌的外植体培养2-3周后，将表面没有染菌的外植体转移到含抗生素的培养基中（附加0.5 mg/L的孔雀石绿和100 mg/L抗生素AAS），继续培养2-3周，对外植体的内生真菌进行杀灭。AAS是青霉素、链霉素、两性霉素B分别按30 mg/L、50 mg/L、125g/L的比例配制而成，现配现用。3. 灭菌后的培养在含抗生素的培养基上培养2-3周后，将表面无菌的外植体转至五抗生素的新鲜培养基中培养。4. 千层塔茎尖外植体的组织培养及丛生苗的发生过程其外植体在培养4-5周后有90%的茎尖顶芽开始萌动生长，通过发现有4中方式：4.1直立纵向生长不发生二叉分支2-3周后，40%的茎尖开始膨大，变圆，颜色呈浅绿色，在4-5周后新芽直接从茎尖顶部抽出，新芽纵向生长并有新叶形成，生长速度约为5-6mm/月，培养6-8月后，约30%的茎尖中有从形态学下端切口处长出白色或黄色的毛状根。4.2 发生二叉分支3-4周后，约50%的茎尖开始萌动凸起，呈嫩绿色，再3-5周后有细长新芽从顶部抽出，切下有活力的顶芽5-8mm转移至新鲜培养基，在1-2周后，芽的生长速度加快，（约8mm/月），这些芽月20%的发生二叉分枝，发生二叉分枝的外植体在培养3-5月后有新根从外植体的切口处长出，少数的外植体根呈二叉分枝。4.3 发生多叉分支 培养4-6周后，约10%外植体顶芽先膨大形成瘤状结构，表面光泽，呈深绿色，8-10周后，在刘庄提的顶芽又发生新的突起，且突起部位颜色变深，不断变圆，有新芽从顶部抽出，新芽不断变长，2个月后新芽的侧部又有新叶长出，呈多叉分支生长的方式。4.4 形成绿色球状体（GGB） 约0.1%的茎尖在转移后，顶端没有新芽抽出，业务顶端膨大现象，整个外植体五生长现象，但没有死亡，在培养4个月后，该茎尖的底部切口处出现绿色小块，绿色小块迅速生长，逐渐膨大变圆，再2个月后，其表面开始分化，露出小芽。用镊子小心将其从外植体上剥落，转移至新的培养基上继续培养，绿色球状体在2周内没有生长迹象，第2周开始生长，且其表面分化出新芽，随着培养的进行，小芽逐渐分化出一些小苗，丛生芽生长的同时，绿色球状体亚瑟逐渐变深褐色，表面市区光泽，生长月2个月后，这些再生植株高度达到5-8mm，分离再生植株转至新鲜培养基后期长势良好，培养约6个月后其基部又长出新的丛生苗产生。外植体采集时节：12月份培养基：1/4MS矿质元素+1/2有机元素+2%蔗糖外援激素IAA、2.4-D不利于千层塔外植体的生长培养条件：温度25，光照时间 12/h 光照强度 50mol/.s在培养基中添加2m的IAA不仅有助于千层塔丛生苗高的生长，且有利于丛生苗形成新叶。使用浓度为10m的IBA对促进其丛生苗的个体高度生长和生物量的积累效果最佳。2m和10m的IBA能促进其生根，但后者的根更粗壮。BA不利于丛生苗的生长KT对丛生苗新生叶片形成无明显的促进作用。但2m和5m的KT能有效刺激丛生苗个体生长和再生，但与实践有一定关系。（40天左右）千层塔内生真菌1.千层塔内生真菌的分离与纯化取新鲜千层塔茎段，用自来水冲洗干净，浸于70%酒精中消毒4min，无菌水冲洗2次，置于0.1% 升汞溶液中浸泡20min，再用无菌水冲洗4次，然后将茎段种植于MS培养基上，置28恒温箱培养 2周后，取未出现真菌污染的外植体用升汞灭菌15min，切割后接种于PDA培养基中培养。将样品边缘部分长出的菌丝，用接种针挑取接种于PDA培养基平板上，30恒温培养，长出新菌落后，再挑取其尖端菌丝转到PDA培养基平板上重复纯化5次以上，然后接到试管斜面上保存，用于菌种鉴定。将上述表面灭菌处理的材料不作切割置于同样条件下培养，检查表面消毒是否彻底，辨别真菌是否为内生的。羌活1.材料1.1植物材料 羌活来自于四川甘孜九龙海拔4000米以上高山地区。1.2 培养基诱导培养基（1）：MS+KT0.1+2,4-D 0.5-1.5+NAA0.2-0.6增值培养基（2）：MS+KT0.5-2.5+2,4-D 0.5-1诱芽培养基（3）：MS+6-BA 1.5-4.5+NAA 0.5-0.1生根培养基（4）：1/2MS+NAA 0.01-0.05另加0.7-1.0%琼脂、3%蔗糖、0.1-0.5%活性炭1.3.培养条件：温度212、光照时间14h、光照强度1600lx2具体方法2.1外植体的选择与消毒 以羌活萌发的根芽作为外植体，以流水冲3-5分钟，在用浓度为75%的酒精浸泡灭菌45-60s，以无菌去离子水冲洗2-3次，在将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌10-15分钟，在用无菌去离子水冲洗4-5次，备用。2.2外植体接种 将上述步骤备用的外植体切成0.1-0.3cm3的小块。接种在培养基（1）中，培养时间为30-35天，在根芽切口处膨大形成愈伤组织。2.3.愈伤组织的增值 将上述步骤得到的愈伤组织接种到培养基（2）中，培养25-35天，长出黄色、致密愈伤组织。2.4芽的诱导将上述步骤得到的愈伤组织接种到培养基（3）中，培养35-45天，出现丛生羌活苗，2.5生根培养 将上述步骤得到的丛生芽进行分株，转入培养基（4）中，待培养20-30天，小苗基部出现白色短根并长出完整根系。3结果与讨论3.1愈伤组织的诱导情况，在不同培养基中诱导情况不一样，选择最佳的培养基，同时，在诱导时，选择什么样的培养条件，对于羌活来说，是光培养好，还是暗培养好。3.2 愈伤组织的筛选：在不同条件下，不同培养基中，诱导出的愈伤组织颜色不同，这对后续愈伤组织诱导出芽有很大的影响，筛选最佳愈伤组织进行扩大培养。4.3.3 据有关报道，在羌活组织培养中，最后一步羌活苗很难诱导生根，针对这一问题，我们在进行培养的状况下，我们还设计了在瓶外生根的办法，如采用滤纸桥生根技术，在试管内先诱导根源基在进行移栽，采用生根小室，盆插或瓶插生根法等。5羌活的提取方法5.1乙醇加热回流提取紫花前胡苷、异欧前胡素、羌活醇5.2水蒸气蒸馏法(SD)和超临界CO2萃取法(SFE-CO2)所提取羌活挥发油的化学成分及其含量6.在生产过程中遇到的问题及解决方法6.1 将羌活的高山移到平地种植的可能性。从目前种植的情况看，直接移栽到平地上种植可能性不大，但若我们从基因水平，在羌活苗中注入抗平地高温高湿的基因，是否可以移栽成功。6.2 羌活野生条件下生长时间长，通过组织培养获得的羌活苗在进行移栽时是否可以缩短时间年限，提高产量。6.3 在移栽的过程中，对羌活的化学成分是否会引起较大的变化。6.4 在羌活组织培养中，可以测定愈伤组织、芽、完整植株里其化学成分含量，若含量高，我们可以直接在这一步进行提取，以节约时间，提高效率。6.5 在进行羌活人工种植，组织培养研究的基础上，我们还可以进行细胞培养，毛根技术等生物技术领域进行研究，从而从根本上解决羌活资源短缺问题，但这方面的研究领域目前未有相关报道。独活独活的组织培养诱导培养基（1）：MS+6-BA0.5+2.4-D 2增值培养基（2）：MS+6-BA0.2+2.4-D 2诱芽培养基（3）：MS+6-BA2.0生根培养基（3）：MS+NAA 0.2+IAA0.5培养条件：。培养温度为252, 光照周期为12h,光照强度为20002500Lx。4.1外植体的选择将幼叶用自来水洗净，流水冲3-5min，滤纸吸干，然后用浓度为70的酒精浸泡30-60s，无菌水冲洗23次，再用HgC12，浸泡10min，无菌水冲洗45次。4.2愈伤组织的诱导将消毒过的叶片切成0.5cm左右的小段，接于MS诱导培养基上。培养7d，外植体膨大，卷曲，愈伤组织开始萌动，出现如针尖大小的菜花状愈伤组织。培养30天后，有愈伤组织发生，愈伤组织呈透明的乳白色。4.3继代增值在愈伤组织诱导培养3周左右，选取最佳的愈伤组织进行继代培养。愈伤组织继代过程增殖较快、状态好，继代次数延长至6次也无分化。4.4分化实验将继代培养基中略有分化愈伤组织以及未见分化的愈伤组织转接至分化培养基上。将继代培养基上状态好的愈伤组织转入分化培养基后，14d左右分化出大量的绿色芽点，继续培养 3周左右，可得到叶片簇生的小苗，叶片上着生白色的绒毛；一部分苗的叶片绒毛在继续培养时消失，叶片透明、质硬、易碎，呈典型的玻璃化症状。 4.5抗玻璃化实验将培养基中琼脂含量由0.5提高到0.8，与此同时，在苗转人生根培养基之后，于12：00将培养瓶置于太阳光照下12h，连续 3d。4.6生根培养小苗转入生根培养基后，经过抗玻璃化处理，叶片玻璃化情况明显得以改善，叶片叶柄转绿，叶缘呈明显锯齿状。4.7结果与讨论4.7.1 目前关于独活植物组织培养及其他生物技术方面的报道很少，只有谭兴等报道了关于白亮独活的组织培养与植株再生研究。其以叶片为外植体，建立了植株再生体系。4.7.2 在独活愈伤组织形成过程中，在培养基（6-BA0.5+2.4-D 2）在愈伤组织分化出芽点，然后分化出单叶，叶片玻璃化，在身所处的培养基中的生长调节物质。愈伤组织在含有2.4-D 4+ Kt0.5和2.4-D 4+ Kt1.0时生长的一部分愈伤组织分化出根，而将根转接至分化培养基进行芽诱导时，根先愈伤化，继而褐化死亡，我们将其2.4-D的浓度降低，是否可以加快独活愈伤组织分化能力，部分分化出根，芽，进而分化出完整植株。4.7.3独活分化出芽在进行生根培养时，叶片很容易玻璃化，即表现为是试管苗植株矮小肿胀、半透明玻璃状，叶片呈浅绿色或黄绿色，叶片增厚而狭长，有时基部较宽，叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易破碎；叶表面缺少角质层和腊质或腊质发育不全；茎短、粗、扁平、节间很短或几乎没有节间。抗玻璃化的措施有：选择合适的激素种类和浓度，适当减少细胞分裂素用量或适当增加生长素的比例；适当延长光照时间或增加自然光照，适当提高培养基中无机盐的含量，减少铵态氮而提高硝态氮的用量；在培养基中加入活性炭、间苯三酚、根皮甘、PVA等。4.7.4由于关于独活植物组织培养的报道非常少，因此，对于独活在整个过程中发生的各种实验结果均有可能，具体的以实验数据为主。4.7.5独活愈伤组织分化出芽容易玻璃化，我们直接进行独活的细胞悬浮培养。将得到的愈伤组织称取2g接种于含100ml的培养液（MS+0.2mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA）中的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25，光照12h，每培养7-10天更换一次培养基，继代3-4次后逐渐形成稳定且大小均一的颗粒状细胞团悬浮培养体系。最后进行含量测定。4.7.6 在独活愈伤组织阶段，我们进行其化学成分及含量测定，若其含量高我们可以直接进行提取分离。目前关于这方面的无相关报道。半夏1.半夏的组织培养技术培养基：（1）MS+6-BA 0.5+NAA 0.5（2）：MS+6-BA 1+NAA 0.5（3）：MS+6-BA 1.5+NAA 1（4）：MS+6-BA 1.5+NAA 0.5（5）：1/2MS+NAA 0.5培养条件：温度252、湿度24.5%、RH12h散射光 +12h黑暗1.1外植体的选择半夏长出叶后，取半夏叶片、叶柄、珠芽、块茎作为外植体自来水冲洗干净，剪成适当大小于超净工作台中用75%的乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗3遍，再置于0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后用无菌水再冲洗5遍，叶片切成0.25 cm2的小块，叶柄切成0.5-1cm 长的小段备用。1.2外植体接种将处理好的外植体在无菌条件下分别接种到上述（1）（4）四种培养基中。接种方式：叶片背面接触培养基，叶柄横向放置，珠芽水平放置，块茎形态学下端接触培养基。培养条件：温度252，湿度24.5%，光照培养时间12h散射光。1.3植株再生途径1.3.1叶片接种10d后，（2）号培养基中的叶片边缘突起，在切口处形成少量愈伤组织，愈伤组织诱导率达100%；20d后愈伤组织大量生长，呈淡黄色，结构疏松；30d后愈伤组织上长出小芽；40d后愈伤组织上形成大量丛生芽，但是小苗比较细弱；同时再生植株下面长出幼根。1.3.2叶柄接种7d后，（2）号培养基中的叶柄中间突起；30d后形成明显愈伤组织质地疏松，呈淡黄色或白色，愈伤组织诱导率达67%；40d后平均每块愈伤组织上形成3个小芽。1.3.3株芽接种5d后，（3）号培养基中的珠芽膨大；7d后形成小芽；30d后小芽快速生长，同时珠芽上又长出5-8个小芽。1.3.4块茎接种10d后,在上述四种培养基中块茎均产生1-2个小芽；40d后小芽迅速长大，同时又形成多个小芽。其中（3）号培养基中产生的小芽数目最多，平均5个，故块茎最适号培养基。1.4生根培养 当叶柄、珠芽和块茎上形成的小苗长到6-8cm时，从叶柄基部切取小苗接种入5号培养基中，10d后叶柄基部形成大量根。1.5移栽移栽2d后小苗恢复生长，其中由叶片愈伤组织形成的小苗由于比较细弱，成活率较低，为70% 而由珠芽和块茎形成的小苗移栽后成活率达90%。1.6半夏组织培养苗形态半夏组织培养苗的叶基生，均为一片单叶，卵状心形，块茎近球形，和自然条件下一年生半夏的形态一致。但是组织培养苗的叶柄细长、弯曲，可能是受生长环境的影响所致。1.7结论1.7.1叶片和叶柄是通过愈伤组织途径形成植株的，而株芽和块茎是通过非愈伤组织形成植株的。但在不同培养基上，株芽和块茎也可以通过愈伤组织途径形成植株。1.7.2 疏松愈伤组织与致密愈伤组织的差别:再分化过程中 ,致密愈伤组织分化所需时间长，但分化率较高，说明二者有区别。1.7.3两种来源小块茎的结构差异：何奕昆认为无论从愈伤组织还是从外植体直接形成植株，都是通过小块茎途径完成的(一些文章中称之为球状体)，并对小块茎的形态建成进行了阐述7。另外，从愈伤组织得来的小块茎比从外植体直接得到的小块茎分化出根和芽的时间较短，这表明两种来源的小块茎结构上存在差异。1.7.4在外植体球状体具根芽的完整植株的过程中，未经过脱分化而完成了再分化，组培物发生了那些内部结构上的变化。另外 ，吴伯骥9通过叶肉原生质体诱导出了胚性愈伤组织，胚性愈伤组织进一步发育成胚状体；吴爱民16的实验表明：掌叶半夏（P.pedat isecta Schot t ）种子在附加2，4-D 2.0mg/L，6-BA0.5mg/L的MS培养基上形成颗粒状胚性愈伤组织，胚性愈伤组织在附加 2，4-D1.0mg/L，BA 0.5mg/L，CH300 mg/L的液体培养基上振荡培养 ，产生了大量的体细胞胚。那么，三叶半夏的其他外植体，如块茎、珠芽、叶片和叶柄也能诱导出胚状体吗？如果可以，是直接诱导，还是通过胚性愈伤组织的间接诱导方式？三叶半夏的种子呢？1.8半夏组织培养中成分的比较郭余龙等研究表明，半夏培养物总生物碱含量明显高于野生块茎，二者生物碱成分薄层扫描的吸收光谱完全相同，薄层层析图谱基本一致。曾建红等探讨了不同激素种类配比的培养基对半夏培养物生物碱合成的影响，结果表明MS+NAA 2.0+ KT0.5培养基最适合半夏培养物生物碱的积累，平均高达0.9802%，不含2，4-D的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱明显高于含有2，4-D的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱。因此，激素种类和配比对半夏组织培养物中生物碱含量的影响较大。在实验阶段，通过大量实验来研究证明，以寻求一条最有效的途径，使半夏在成分的积累方面得到最大化。2半夏的细胞悬浮培养贾永芳等人采用半夏细胞悬浮培养对植株再生进行了研究，发现将半夏幼嫩叶片在MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BA培养基上一个月内可以诱导出较好的愈伤组织，取颜色鲜黄的愈伤组织进行悬浮培养，经3-4次继代后得到分散性好的半夏细胞悬浮系，并将细胞悬浮液过滤获得到的小细胞团接种于MS + 0.2 mg/L NAA + 1.0 mg/L BA分化培养基上，40 d后分化出小植株。侯学文(2000)以B5培养基，添加4.5 umol/L 2,4-D和2.3 umol/L KT为基本培养基，设置20、30、40、50 g/L蔗糖，考察不同蔗糖浓度对玫瑰茄细胞生长的影响，发现蔗糖浓度在20-50 g/L范围内，当40 g/L时，蔗糖是作为限制性基质而存在的，而蔗糖浓度超过40 g/L时，蔗糖就表现出基质抑制效应。范美华(2004)在悬浮培养中比较两种碳源，发现葡萄糖比蔗糖更有利于愈伤组织的生长和总生物碱的合成，同时对钙盐、Fe盐及肌醇发现钙盐浓度为1.8 mmol/L、Fe盐浓度为0.06 mmol/L和肌醇浓度为100mg/L最适合细胞生长和总生物碱形成。罗成科(2006)利用半夏幼嫩叶片接种到固体愈伤组织诱导培养基(MS + 3%蔗糖 + 0.7%琼脂 + 3.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BA)获得的愈伤组织继代到液体培养基(MS + 3% 蔗糖 + 3.0 mg/ L2,4-D + 0.5 mg/L BA + 300 mg/L LH)中上，建立了胚性细胞悬浮系。刘永红（2010）将外植体在MS + 0.2 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA的培养基上诱导出未的分化的小块茎继代于添加0.6 mg/L ABA的1/2MS液体培养基中，建立了小块茎的悬浮培养体系。同时发现组培小块茎的总生物碱含量都高于栽培块茎。丁兰(2007)以1/2 MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BA + 0.5 mg/L NAA为培养基,培养条件为温度232,转速90 rpm、pH值6.0进行半夏悬浮培养,发现黑暗培养有利于悬浮细胞的增殖,悬浮继代培养后，再添加0.5 mg/L BA + 0.5 mg/L NAA可诱导分化出芽和根,形成完整的植株。低温诱导细胞同步化可以克服化学药物筛选法容易引起染色体变异的缺点,并且操作起来简单、方便。毛春娜(2011)探索适合半夏悬浮培养细胞的低温诱导同步化时，发现8低温下处理24小时效果最好。在组织培养的基础上，通过细胞悬浮培养，刘永红利用半夏小块茎诱导的愈伤组织细胞系其总生物碱含量为0.0293%，比栽培块茎的生物碱含量（0.0072%）高；在悬浮细胞系中，其葫芦巴碱含量0.412g/g，比栽培块茎高出6.8倍。培养液：（1）MS + 0.2 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA（2）MS + 0.2 mg/L NAA + 1.0 mg/LKin（3）MS + 1.0 mg/L IBA + 3.0 mg/L 6-BA2.1半夏愈伤组织悬浮培养体系的建立将得到的愈伤组织称取2g接种于含100ml的培养液（1）、（2）、（3）中的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25，光照12h，每培养7-10天更换一次培养基，继代3-4次后逐渐形成稳定且大小均一的颗粒状细胞团悬浮培养体系。最后进行含量测定。在半夏的细胞悬浮培养中，得到的愈伤组织类型不同，其生长、增值能力差异也较大。因此，其生物碱含量也有所不同。2.2半夏小块茎悬浮体系的建立将组培中得到的小块茎称取3g接种于1/2MS+0.6 mg/LABA中，的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25，光照12h。观察其生长曲线，生长形态，并进行含量测定。2.3结果与讨论在进行细胞悬浮体系的培养中，调控培养条件，会出现多种愈伤组织类型，其生长、增值能力均不一样，因此，会影响其培养的效果，因此，这就需要我们在实验过程中进行筛选。在进行愈伤组织和小块茎的悬浮培养中，哪种更有优越性，需实验进一步证明。3.半夏的人工种子技术组织培养的半夏试管苗存在着远距离运输和贮藏的问题，在生产中难于推广。自从制作人工种子设想被提出后，植物人工种子的研制，就成为生物技术研究中活跃的领域之一。半夏组织培养中小块茎发生率高，筛选方便 ，萌发率高，用半夏小块茎制作人工种子，可克服用体细胞制作人工种子中存在的体细胞胚发生率低、 筛选难、 萌发率低的难题 ,目前具有用于生产的实际可能性。何奕昆等44用半夏愈伤组织表面形成的小块茎制作人工种子，在无菌和有菌条件下的萌发率分别为70%和30 %.。张苏锋 45 以半夏株芽生长的茎尖作外植体诱导小块茎，筛选直径 5 mm的小块茎制作人工种子。人工种子在有菌条件下萌发，30d后统计成苗率为 98.4 %。人工种子苗块茎产量是栽培苗的2.02倍，是试管苗的1.33倍，生物碱含量是栽培苗的1.62倍，是试管苗的1.12倍，是野生苗的1.17 倍.。薛建平等46以半夏试管小块茎为材料，以海藻酸钠、壳聚糖等为种皮基质，添加适