Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较.pdf

Lowry 法和法和Bradford 法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较 杨桂兰 郭学平 Lowry 改良的酚试剂法 简称 Lowry 法 和 Bradford 染料结合法 简 称 Bradford 法 是两种常用的蛋白质测定方法 在用于测定玻璃酸中作为杂 质的蛋白质的含量时 发现两种方法的测定结果差异很大 本文用实验和有 关文献对此进行分析 1 材料材料 考马斯亮蓝 G 250 分析纯 上海化学试剂站进口分装 牛血清白蛋白 BSA 中国药品生物制品检定所 碱性蛋白酶 丹麦 Novonordisk 公司 玻璃酸钠 HA 山东福瑞达精细化工有限公司 紫外可见光分光光度计 日本岛津公司 2 方法方法 2 1 Lowry 法法 1 2 精密称取 HA 500mg 置于 100ml 量瓶中 加水溶解至刻度 依法测定 2 2 Bradford 法法 3 4 2 2 1 考马斯亮蓝试液配制 考马斯亮蓝 100mg 溶于 95 乙醇 50ml 再加 85 磷酸 100ml 加水稀释至 800ml 过滤备用 2 2 2 标准曲线制作 取 BSA 10mg 精密称定 置于 100ml 量瓶中 加水 溶解并稀释至刻度 制得 100 g ml 的 BSA 对照品溶液 取具塞试管 6 支 分别加入 BSA 标准液 0 00 0 05 0 10 0 20 0 40 0 60ml 均补加水至 1 0ml 得到含 BSA 0 5 10 20 40 60 g 的标准系列 分别加入考马斯亮蓝试液 4ml 立即混匀 5min 后在 595nm 波长处用 1cm 比色池测定吸收度 以 BSA PDF created with pdfFactory trial version 质量 g 对吸收度作图 得标准曲线 或计算出直线回归方程 2 2 3 供试品测定 取 HA 500mg 精密称定 置于 100ml 量瓶中 加水溶 解至刻度 取 1ml 于具塞刻度试管中 以下同 2 2 2 项下测定吸收度 从标准 曲线得到蛋白质质量 g 以此计算 HA 供试品的蛋白质含量 2 3 Bradford 法测定法测定 HA 溶液中蛋白质的回收实验溶液中蛋白质的回收实验 取 BSA 50mg 精密称定 溶于 0 5 的 HA 溶液 50ml 中 再用 HA 溶 液稀释成含 BSA 5 40 60 80 g ml 的溶液 以 0 5 HA 溶液为空白 用 Bradford 法测定 BSA 溶液的蛋白质浓度 2 4 BSA 水溶液酶解前后蛋白质含量的测定水溶液酶解前后蛋白质含量的测定 取 BSA 200mg 精密称定 加水溶解至 200ml 取 100ml 用稀氢氧化钠 溶液调 pH8 5 加 1mg ml 的碱性蛋白酶溶液 1ml 50 酶解 5h 期间维持 pH 8 0 8 5 分别取酶解前后的 BSA 溶液 1ml 于 100ml 量瓶中 加水至刻度 用两种方法分别测定蛋白质的含量 3 结果结果 3 1 HA 供试品中蛋白质的含量供试品中蛋白质的含量 Lowry 法标准曲线的回归方程式为 C 6 44 290 0A r 0 9991 Bradford 法标准曲线的回归方程式为 C 0 53 147 62 0 9993 式 中 A 为吸收度 C 为显色试管中蛋白质的质量 g r 为相关系数 根据两 种方法的标准曲线斜率之比可计算出 Bradford 法对 BSA 的显色灵敏度约是 Lowry 法的两倍 两种方法所测 HA 供试品中的蛋白质含量见表 1 Lowry 法 测定结果明显高于 Bradford 法 表表 1 HA 供试品中的蛋白质含量测定值 供试品中的蛋白质含量测定值 n 2 PDF created with pdfFactory trial version HA 供试品号 Lowry 法 Bradford 法 1 1 30 0 35 2 0 14 0 06 3 0 76 0 01 4 0 70 0 04 3 2 Bradford 法在法在 0 5 HA 溶液中测定蛋白质的回收率实验结果溶液中测定蛋白质的回收率实验结果 Bradford 法的回收实验结果 见表 2 表明 在 0 5 HA 溶液中该法测定 蛋白质的回收率在 100 左右 符合方法学要求 同时本结果还证实 HA 对 Bradford 法无干扰 表表 2 Bradford 法测定法测定 BSA 的回收率的回收率 n 4 BSA 浓度 g ml 实测值 g ml 回收 率 5 4 74 94 8 40 43 44 108 6 60 62 28 103 8 80 79 42 99 3 3 3 BSA 溶液酶解前后的蛋白质含量溶液酶解前后的蛋白质含量 Lowry 法测定 BSA 溶液酶解前后的蛋白质含量分别为 998 1225 g ml Bradford 法测定 BSA 溶液酶解前后的蛋白质含量分别为 1160 100 g ml 结 果截然相反 酶解后 Lowry 法的测定值略有升高 而 Bradford 法的测定值大 幅度下降 4 讨论讨论 测定 HA 供试品中的微量蛋白质杂质含量时 Lowry 法的测定值显著高 于 Bradford 法 可能有两个原因 即不同的测定反应机制和供试品中作为 PDF created with pdfFactory trial version 主要成分 HA 的干扰 回收率实验结果排除了后一种原因 Lowry 法测定值高 是其反应机制所决定的 该法所用的 Folin 酚试剂 与酚反应呈现出蓝色 进 行蛋白质测定时 该试剂与酪氨酸和色氨酸等特定的氨基酸残基作用 产生 显色反应 Lowry 等在 Folin 酚试剂法的基础上 加入了双缩脲法的优点 进行了改 良 双缩脲法是利用碱性硫酸铜试液中的 Cu2 与肽键络合而产生的显色反应 两种显色机制的协同作用 使 Lowry 改良的 Folin 酚试剂法 显色强度提高 3 15 倍 灵敏度为双缩脲法的 100 倍 由此机制可以看出 Lowry 法对蛋白 质和分子较小的多肽 具有同样的显色反应 本研究用对 BSA 溶液酶解前后 进行蛋白测定的试验证实了这一点 而对于 Bradford 染料结合法 酶解后测 定值下降至约 1 10 说明多肽对 Bradford 法基本无干扰作用 实验中加入的 酶只占 BSA 的 1 而两种方法所加酶量相等 故酶本身与结果对比 基本 无影响 Lowry 法和 Bradford 法的比较见表 3 HA 供试品中含有混合蛋白质和多 肽等杂质 用 Lowry 法测定蛋白质时 多肽也有显色反应 故测定值偏高 多肽的分子链比蛋白质短 一般无致敏作用 而测定 HA 产品中微量蛋白质 的主要目的是将蛋白质含量控制在限量之下 根据被测物质中蛋白质为少量 成分时 应选用 Bradford 法的原则 2 以及上述试验结果 作者认为测定 HA 产品中的微量蛋白质 选用 Bradford 法更适合 使用 BSA 作为蛋白质测定用对照品应注意下述问题 4 所用 BSA 应有足 够的纯度 不含脂质 无机盐和非蛋白氮化合物 低温保存 使用前应用五 氧化二磷对其进行真空干燥 可用光吸收法 对 BSA 的纯度或称量精度进行 PDF created with pdfFactory trial version 验证 即在 279nm 波长处测定 1mg ml 的 BSA 溶液吸收度 应为 0 667 表表 3 Lowry 法和法和 Bradford 法的比较法的比较 2 4 方法 原理 有效范围 和灵敏度 优缺点 干扰物 适用供试品 Lowry 法 Cu2 与肽键的 络合及氨基 酸对 Folin 酚 试剂的还原 1 0 200 g A750 1 3 3 灵敏度较低 试 剂配制及测定操 作复杂 蛋白质 的种类对结果有 影响 酚 甘氨 EDTA 硫 酸铵 肽 蛋白质为主 要成分的物 质 Bradfor 法 与蛋白质结 合导致的颜 色改变 0 3 2 5 g A595 1 9 0 灵敏度高 只用 一种试剂 操作 简单 迅速 蛋 白质的种类对结 果有影响 表面活性 剂 碱 蛋白质为少 量成分的物 质 参考文献参考文献 1 Lowry OH Rosebrough NJ Farr AL et al J Biol Chem 1951 193 265 2 董纯定 生化药物分析 南京 中国药科大学出版 1995 142 150 3 Bradford MM Anal