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分类号密级 UDC学位论文能源植物黄连木遗传多样性的SSR及ISSR分析（中文题名） ISSR Analysis and SSR Analysis of Genetic Diversity in Bio-diesel Plant, Pisticia chinensis （Anacardiaceae） （英文题名） 郝丽娟 （作者姓名）指导教师 张志翔教授 申请学位级别 硕 士 学科专业名称 野生动植物保护与利用 研 究 方 向 黄连木生物遗传多样性 论文提交日期 2011年4月 论文答辩日期 2011年6月 学位授予日期 答辩委员会主席： 评阅人：北京林业大学独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得北京林业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名： 日期： 关于论文使用授权的说明本人完全了解北京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名： 导师签名： 日期： 摘要摘要黄连木（Pisticia chinensis Bunge）是一个重要的生物质柴油树种，为探讨不同居群间黄连木遗传多样性及地理变化规律，分别对采自河南、河北、山东、山西、湖南、湖北、安徽、江苏、浙江、四川、贵州、甘肃等地区的黄连进行SSR及ISSR分析,结果表明：1. 利用9对SSR引物对13个黄连木天然居群进行微卫星分析，并按照省、经度和纬度计算黄连木遗传距离和聚类分析。结果表明，在232个单株中检测到37个等位基因，期望杂合度He为0.5714，Shannon多样性指数I为1.0370，平均多态信息含量（PIC）为0.5458，说明黄连木居群具有较高的遗传多样性。聚类分析结果表明，相邻省份、经度、纬度的黄连木区组基本归为同一类群，说明黄连木的遗传关系与地理位置有着密切的相关性，并且遗传距离按经纬度划分较省份划分更具规律性，本研究为黄连木种质资源的选优及育种提供参考依据。2. 从100条ISSR引物中筛筛选出9个适于黄连木进行ISSR扩增的多态性高、扩增条带清晰的引物。建立、优化了黄连木ISSR-PCR反应的技术体系。结果表明，有效等位基因数（Ne）为1.0393，Shannon多样性指数I为0.0902，Neis基因多样性（h）为0.0372。聚类分析结果表明，相邻省份的黄连木居群基本归为一类。3. 基于SSR和ISSR扩增构建相应的Neis（1979）遗传距离矩阵，以及UPGMA树图。比较SSR和ISSR标记构建的聚类图，两者趋势大致相近，但不完全相同。关键词：黄连木；ISSR；SSR；遗传多样性；能源植物黄连木遗传多样性SSR及ISSR分析能源植物黄连木遗传多样性的SSR及ISSR分析ISSR Analysis and SSR Analysis of Genetic Diversity in Bio-diesel Plant, Pisticia chinensis （Anacardiaceae）Master Candidate: Hao lijuan（Speciality of Conservation and untilization of wildlife）Directed by Professpr Zhang ZhixiangABSTRACTPisticia chinensis Bunge is an important bio-diesel tree in China. It is of significance to study on the genetic diversity and geographic variation trend. Genetic diversity and differentiation of natural populations including Henan, Hebei, Shandong, Shanxi, Hunan, Hubei, Anhui, Jiangsu, Zhejiang, Sichuan, Guizhou, Gansu and other provinces, were revealed by SSR and ISSR makers. The result as follows: 1. We analyzed the genetic diversity of 13 natural populations of P. chinensis using 9 pairs of SSR primers, and calculate the genetic distance and dendrogram of them among different provinces, longitudes and latitudes. A total of 37 alleles were detected, the average expected heterozygosity （He） was 0.5714, the Shannon index （I） was 1.0370 and the polymorphism information content （PIC） of all samples was 0.5458, indicating high level of genetic diversity of the species. The P. chinensis located on contiguous province, longitude and latitude were basically clustered into same group. The results showed there was close correlation between relatives and geographic location. Therefore, it is more reasonable to analyze genetic diversity of the P. chinensis grouping according to longitude and latitude than to province. The results provide the basis for optima selection of P. chinensis germplasm resources and breeding.2. We selected 9 primers from 100 primers which amplified high polymorphism and clear bands for P. chinensis ISSR amplification. The technical system of ISSR-PCR reaction for P. chinensis was established and optimized. The results showed that effective number of alleles （Ne） was 1.0393, the Shannon index （I） was 1.0370 and Neis genetic diversity （h） was 0.0372. The cluster analysis showed that the P. chinensis located on contiguous province, basically clustered into same group.3. The matrixes of genetic distance were established on SSR and ISSR fingerprint, respectively. The results of UPGMA cluster analysis based on SSR and ISSR fingerprint had the approximate trend, but not the same.Key words: Pisticia chinensis Bunge, ISSR, SSR, genetic diversity 目录目录摘要IABSTRACTIII引言11文献综述31.1黄连木生物学特性及分布31.1.1分类及生物学特性31.1.2地理分布31.2国内外研究现状41.2.1生殖生态学研究41.2.2 繁育技术51.2.3 病虫害防治51.2.4 引种栽培技术61.2.5 生理学研究61.3 植物遗传多样性研究进展71.3.1植物遗传多样性检查方法的发展概况71.3.2分子标记概述71.3.3 本实验所选取的分子标记：SSR和ISSR分子标记概述81.4研究内容和技术路线92基因组DNA的制备122.1材料122.1.1播种育苗122.1.2野外采集122.1.3主要仪器132.1.4溶液配制142.2实验方法142.2.1 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取法142.2.2基因组提取试剂盒提取法152.3 结果与分析152.3.1 CTAB法提取基因组DNA质量检查152.3.2 试剂盒提取基因组DNA质量检查162.4讨论172.4.1黄连木样品172.4.2 DNA制备方法比较172.5小结173 黄连木遗传多样性的SSR分析183.1材料和方法183.1.1材料和试剂183.1.2仪器和设备183.2方法193.2.1 SSR-PCR体系193.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测203.2.3数据分析213.3结果与分析223.3.1不同省份间黄连木居群遗传多样性223.3.2不同省份黄连木居群关系243.3.3不同纬度间黄连木居群关系253.3.4不同经度间黄连木居群关系263.4讨论273.4.1影响硝酸银染色的因素273.4.2黄连木遗传多样性283.4.3黄连木遗传距离283.4.4黄连木种源区划293.5小结294 黄连木遗传多样性的ISSR分析314.1材料和方法314.1.1材料和试剂314.1.2仪器和设备314.2方法314.2.1 ISSR-PCR扩增反应体系的优化314.2.2 ISSR-PCR扩增引物的筛选334.2.3琼脂糖凝胶电泳检查334.2.4数据分析334.3结果与分析344.3.1 ISSR-PCR扩增反应体系的建立344.3.2 ISSR-PCR扩增引物的筛选364.3.3琼脂糖电泳检查结果384.3.4遗传多样性分析394.3.5黄连木遗传距离404.4讨论424.4.1黄连木ISSR反应体系的优化424.4.2 黄连木遗传多样性的ISSR分析434.4.3 黄连木遗传距离435结论45个人简介47导师简介48获得成果目录清单50致谢51参考文献53附录57引言引言随着全球经济的不断发展，各国对于能源的需求也在不断扩大。目前人类使用的主要是煤炭、石油、天然气等化石能源。但化石能源是不可再生资源，数量也极其有限，最终会被消耗殆尽，并且燃烧会产生的CO2、SO2等有害物质，SO2会严重污染环境，CO2是温室气体会导致气候变暖，进而引起生物物种多样性降低等诸多生态问题的出现。对人类生存和社会的可持续发展产生严重威胁。然而可再生资源如太阳能、风能、潮汐能的生产和利用不容易被控制和掌握。所以当今人类面临的一项重大而急迫的任务是使用可再生能源来替代有限的石化能源，这就需要我们不断地开发新能源（PanjH，2004）。生物质能源是一种清洁、安全、高效、可持续的能源。生物质能源是直接或间接利用绿色植物光合作用形成的可再能源，它具有低碳、低含硫量和灰分、高含氢量的能源（陈金波，2009）。生物柴油是 “绿色能源”的代表，具有高效、安全、清洁等石化能源所无法超越的优越性能，在石油能源日益短缺的情况下，生物柴油处于发展的核心地位。近年来生物柴油产业迅速发展成为一个全球性的新兴产业，引起了世界各国的高度重视和广泛关注（魏小平等，2003；周良虹等，2005）。目前，我国可利用能源植物无论在种类还是品种上均不多，人工栽培面积相对较小且分布零散，很多具有优良性状的能源植物品种尚未被开发处于野生状态（李昌珠等，2005）。中国黄连木（Pistacia chinensi Bunge）是漆树科黄连木属落叶乔木，耐干旱瘠薄，生长缓慢，在肥沃、湿润、排水良好的土壤和河沟附近生长良好（曹应伟等，2010）。在我国境内分布广泛，具有药用、园林绿化等多方面的应用价值，果实含油率在40%左右，是我国优质的木本油料树种。经权威部门鉴定，黄连木种子生产的生物柴油主要理化指标达到中国轻质燃料油标准S6T以及美国生物质燃料油标准，所以黄连木是极具开发利用前景的生物质液体燃料树种（王涛，2005），对于缓解我国能源矛盾具有重要作用，开发利用潜力巨大。物种的遗传多样性是其赖以生存、发展和进化的基础，遗传多样性越丰富，其适应性进化的潜力就越高，适应环境变化的能力也越强。了解物种遗传多样性水平和遗传变异的空间分布格局对于制定科学的基因资源保护策略具有重要意义，也是动植物育种和遗传改良的理论基础。65文献综述1文献综述1.1黄连木生物学特性及分布1.1.1分类及生物学特性黄连木（Pisticia chinensis Bunge），又名黄连芽（湖南）、黄儿茶（湖北）、烂心木（台湾）、黄连树（云南）、药树（甘肃）、凉茶树（贵州）、岩拐角（四川），属漆树科（Anacardiaceae）黄连木属（Pistacia L.）植物，黄连木属约十种，分布于地中海沿岸、中亚至东亚、墨西哥至危地拉马。中国3种，其中引入阿月浑子（中国植物志编辑委会，1979）。黄连木是落叶乔木，偶数羽状复叶，雌雄异株，先花后叶，核果球形，略压扁，红色果实为空粒，种子败育，绿色果实内种子发育花期34月，果实成熟期911月（张志翔，2008）。黄连木喜光，幼时耐荫能力较强，耐寒力差。对土壤的要求不严，微酸性、中性和微碱性的土壤都可以生长，是石灰岩山地、沿海地区都可利用的造林树种，也是石漠化治理的有良树种。黄连木耐干旱瘠薄，生长缓慢，在肥沃、湿润、排水良好的土壤和河沟附近生长良好。黄连木属深根性树种，主根发达，萌芽能力强（曹应伟等，2010）。黄连木是木本油料植物，种子含油量（带壳）均在20%30%之间。不饱和脂肪酸含量86.4188.33（李晓旭，2008），与其他野生油料不同，只有绿色的才含油最多，红色的或黄色的都不含油，紫色的含油少，研究分析黄连木籽油的理化性质如下：碘值111.00，皂化值193.0；脂肪酸组成：肉豆蔻酸0.3，棕榈酸15.6，硬脂酸0.9，十六碳烯酸1.2，油酸51.6，亚油酸28.3，亚麻酸2.1（钱建军等，2010）。1.1.2地理分布黄连木原产中国，在我国北京、河北、河南、山东、山西、安徽、福建、江苏、浙江、上海、湖南、湖北、陕西、西藏、四川、贵州、云南、广东、海南等19个省、自治区、直辖市均有分布，跨越东经965212314，北纬18094009之间的广大地区，一般分布于海拔2000m 以下，只有少量黄连木分布于2000m 以上的山地，而在海拔12m 的沿海滩涂地带亦有黄连木分布（王涛，2006）。黄连木的水平分布区主要位于云南潞西西藏察隅四川甘孜青海循化甘肃天水陕西富县山西阳城河北顺平北京西山一线以东、以南，整体上呈现连续分布，但在局部地区呈间断分布；从我国西部到东部，其垂直分布的上限和下限均呈逐渐降低的趋势，从南方到北方，这种降低趋势不太明显；分布区跨越热带、亚热带、温带，以海拔400700 m的石灰岩山地最多，地形以高原、山地为主，土壤母岩以石灰岩为主，土壤类型以褐土为主（侯新村等，2010）。图1 黄连木在中国广泛分布的省区图Fig.1 the Wide distribution of Pistacia chinensis Bunge in China1.2国内外研究现状目前对于木本能源植物黄连木的研究，局限于生殖生态学研究、引种栽培技术、病虫害防治、大田育苗等方面，其中对于黄连木五倍子也有一定的研究，但研究的深度和广度都不够。尤其是现代生物技术的运用欠缺。对于主产中国的黄连木在国外研究较少，但对同属植物阿月浑子（Pistacia.vera L.）研究较多。1.2.1生殖生态学研究 黄连木花粉为单粒，为球形或近球形，花粉粒大小整齐，平均直径为2817Lm；饱满花粉能达到95%以上；每个花药的平均花粉量为1117105粒（邱政芳等，2010）。花粉萌发和花粉管生长的适宜蔗糖浓度为15%，培养温度为25，吲哚乙酸（IAA） 、赤霉素（GA3）和硼酸分别为100、50和15mg/L时，最适合黄连木花粉萌发和花粉管生长，在该条件下花粉萌发率和花粉管长度均达最大值分别为63.3%和412.1m（李旭新等，2009）。 黄连木孢子和雌雄配子体的发育与漆树科科特征相符，呈单或双珠被、厚珠心， 蓼型胚囊，小孢子母细胞的减数分裂为同时型，绒毡层是腺质型，中层23层，小孢子四分体有四面体形和左右对称型两种类型，成熟花粉粒为2核花粉粒（邱政芳，2010）。黄连木是风媒花，因此在传粉过程中对气候条件的要求比较高，授粉好坏直接受温度、湿度、风速和降雨等诸多因素的影响，授粉不良会直接导致结实率降低。同时，树体营养缺乏可能是结实率低的另一个重要原因，黄连木是先花后叶植物，开花时所需的营养主要是消耗树体的贮藏营养，树体营养不足有可能导致性器官发育不良。因此，在生产中，改善树体营养，花期进行人工辅助授粉，将有益于提高结实率（邱政芳等，2010）。 为了能更好的适用微环境，雌雄异株树种的雌树和雄树趋向于利用不同的空间和环境资源（ Freeman D C and Klikoff L G， 1976）。黄连木的幼树、雌树和雄树呈显著聚集性分布，雌树与雄树在空间上相互排斥，即雌树和雄树存在空间分离现象（赵亚洲等，2010）。黄连木雄树的萌蘖能力比雌株强，而黄连木种子颗粒大，传播能力不强，因此新生小植株易于在母树周围进行生长，造成雌雄树周围都会有新生苗成长，各自利用适宜的空间。1.2.2 繁育技术播种育苗是黄连木的主要育苗方法。 由于黄连木种子外被蜡， 属于深眠类型， 不经处理直接播种后发芽比较困难， 在沙藏前必须对种子进行脱蜡处理（徐金燕等，2001）。赵和文等（2004）对采自河北邢台的黄连木种子进行了吸水量、沙藏期间激素、发芽率的测定，确定黄连木种子低温沙藏100d的发芽率最高，经赤霉素处理的种子可以提前打破休眠，同时低浓度的稀土溶液处理对种子发芽也会起促进作用。采用单施氮肥及氮、磷、钾不同配比组合施肥的方法对黄连木幼苗进行处理，发现黄连木幼苗在单施氮肥的情况下，施肥量以株施1gkg-1为宜，并且应多施氮肥，施肥比例以NP2O5K2O=12612为宜（罗守宗，2010）。陈雪莲（2009）等对黄连木的组织培养过程中不同灭菌剂与灭菌时间、不同抑制剂以及不同光照条件等对黄连木组培效果的影响，结果表明，用0.1%升汞灭菌黄连木外植体较合适的时间为812min，半木质化茎是最合适的诱导腋芽的茎段；对于抑制褐变方面，使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）相对较好些；而在培养初期，光照强度对腋芽的诱导情况影响不大。1.2.3 病虫害防治立枯病又称“死苗”，主要是由立枯丝核菌感染引起的，多发生在育苗的中后期。主要危害幼苗茎基部或地下根部，初为椭圆形或不规则暗褐色病斑，病苗早期在白天萎蔫，夜间恢复，病部逐渐凹陷、溢缩，有的渐变为黑褐色，最后干枯死亡，但不倒伏。防治方法：严格选择苗圃地，以前是种植蔬菜、薯类、瓜类及土壤黏重和排水不良的地块不宜做为苗圃；施用的有机肥料特别是厩肥必须经过充分腐熟；播种前用0.50%的高锰酸钾水溶液浸种30min，播种前14天左右使用2g/L的55%敌克松稀释液喷洒土壤进行消毒；幼苗出土后，可用70%的敌克松500倍液进行防治，每隔710d喷撒1次，连续用药23次（曹应伟等， 2010）。黄连木种子小蜂的幼虫以取食黄连木种子的种胚及子叶为食，致使黄连木种子失去食用和加工的价值，丧失发芽力，严重时可造成大片黄连木绝收。主要防治方法：完善营林措施，强化林间管理；加强种子检疫，禁止带虫种子混入；尽可能采尽种子，降低越冬虫口基数；黄连木种子小蜂一般将卵产在种皮内，孵化后直接侵入果实内部，因此一般的喷药防治效果较差，只有抓住防治的关键时期使用内吸性杀虫剂才能有一定效果（王素娟等， 2010）。木橑尺蠖，寄主达30余科170多种植物，黄连木、核桃、紫穗槐等是其最适宜的寄主，是一种暴食性及杂食性害虫。物理防治法，可利用人工防治，即晚秋或早春在黄连木树附近挖出黄连木尺蛾的蛹，降低虫口密度，也可用振落法捕杀黄连木尺蠖幼虫；化学防治，10% 灭百可是防治黄连木尺蠖幼龄幼虫比较理想的药剂；生物防治，保护和利用天敌，如用赤眼蜂防治尺蠖幼虫；也可以在林内养鸡来防治尺蠖幼虫等（曹应伟等，2010）。1.2.4 引种栽培技术黄连木在美国和地中海地区主要作为行道树和园林景观树种被广泛种植（Parfitt D.E.， 2003），Philip McMillan Browse（1988）报道了中国黄连木被引种到地中海地区，表现出高抗寒抗旱性，生长旺盛，冠幅巨大，能起到很好的遮阴效果，在干旱和半干旱地区值得作为遮荫和行道树进行大面积推广。上个世纪80年代在陕西省商洛地区使用飞机将油松种子与催芽处理过的黄连木混合后进行播种，黄连木出苗率能达到40%（候新村，2005）。黄连木耐瘠薄能力较强且根系具有较好的固土能力，是干旱地区较理想的造林树种，进行合理的施肥可以促进黄连木尽快成林和结实，研究表明在4月中旬施肥对黄连木幼苗、幼树的生长有显著效果（魏玉君等，2000）。1.2.5 生理学研究为了了解黄连木幼苗在水分胁迫下生理特性的变化，张春等（2010）以盆栽黄连木的一年生实生苗为试材，在浇水后的第2、7、12、17天测定幼苗叶片水分参数及脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、质膜相对透性等生理指标的变化情况。实验结果表明，轻度胁迫条件下，幼苗叶片丙二醛含量上升，随着胁迫程度的加剧丙二醛含量逐渐下降，脯氨酸含量随胁迫时间的延长呈先减小后增加再减小的趋势，随着水分胁迫程度的增加，黄连木叶片水分饱和亏缺增加，膜系统受到破坏，保护酶系统活性提高。冯蕾（2010）等以黄连木一年生盆栽苗为试验材料，分析不同的盐处理（浓度分别为0、0.15、0.30、0.45、0.60）对根、茎、叶中的Na、K含量的影响。结果表明，随着盐胁迫的加强，黄连木体内的Na含量升高，但不同器官中升高的幅度不同（根系中Na含量最高，茎中的Na含量低于根系，叶片中的Na含量最低），盐胁迫下黄连木叶片内的K含量高于对照，Na变幅不大，说明黄连木的根和茎选择性地运输K而限制了Na的运输，从而减轻了盐胁迫对植株地上部分的毒害，证明黄连木的耐盐能力较强，适宜在土壤含盐量低于0.45的盐碱地区栽植。1.3 植物遗传多样性研究进展1.3.1植物遗传多样性检查方法的发展概况针对生物遗传多样性的检测方法随着生物学研究层次的提高和实验方法的不断改进，也在不断发展。目前，进行遗传多样性检测普遍使用的方法包括（周凌瑜，2008）：（1）形态标记（morphological markers）：形态标记是一种传统遗传标记，通过描述生物外部特性特征来研究不同个体之间的差异。 即研究植物的外部特征， 如株高、粒色、穗长、千粒重等， 具有简单直观的优点，但其多态性差、易受环境条件影响，有比较大的局限性（王日升等， 2006）。（2）细胞标记（cytological markers）：细胞内染色体的数目和结构的变化常常会引起该植物表型的变化。细胞学标记主要是进行染色体核型（包括染色体数目、大小、着丝点位置等）和带型变化的标记。但这种变化表现到表型上的性状不丰富，因此这种标记所能反应的信息数目也是非常有限的。（3）生化标记（biochemical markers）：利用生物化学方法，以基因表达的产物为标对象的一种标记方法，主要包括同工酶、贮藏蛋白和等位酶等。同工酶是基因表达的直接产物，在很大程度上能反映植物个体的遗传差异，但不同种类的同工酶酶谱鉴定物种之间的相似度是不一致的，因此单纯利用一两种同工酶的相似度来判断物种的亲缘关系是不全面的，应由多种同工酶分析来相互印证（汪小飞等，2007）。因其标记数有限，不能完全满足育种工作和种质资源鉴定的需要。（4）分子标记（molecular markers）：是近年来发展非常迅速的一种新型且较为理想的遗传标记方法。它是在植物基因组DNA分子水平上，采用特殊手段来获得能够反映生物居群之间甚至个体之间的具有差异性状的DNA片段，具有下列优点：多态性高；不受外界环境限制，在植物体的各个组织、各发育阶段均可检测到，不存在表达与否的问题；数量极多，遍布整个基因组。1.3.2分子标记概述分子标记是根据基因组内DNA存在丰富的多态性而发展起来一类新型的遗传标记，可以直接反映生物个体在DNA水平上的差异，它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术（贾继增，1996）。理想的分子标记应该达到以下几个要求：具有高的多态性；共显性遗传，即利用分子标记鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；能明确辨别等位基因；除特殊位点的标记除外，能遍布整个基因组；检测手段简单、快速（如试实验程序自动化）；容易获得；选择中性（即无基因多效性）；开发成本和使用成本尽量低廉在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)（黎裕等，1999）。但是现在还没有一种分子标记可以同时具备以上要求。常见的分子标记主要有：限制性片段多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）等。但是，每一种方法都有缺陷（见表1-1），RAPD标记稳定性不强，RFLP技术费用较高且需要使用同位素标记，AFLP技术操作比较繁琐，SSR技术需要预先知道靶序列，根据靶序列设计引物等（邓辉等，2006）。五种分子标记的优缺点见表1-1：表1-1. RFLP、SSR、RAPD、AFLP和ISSR五种分子标记方法比较Tab. 1-1 Comparison among RFLP， SSR， RAPD， AFLP and ISSR指标RFLPSSRRAPDAFLPISSR遗传特性共显性共显性显性显性/共显性显性多态性水平低高中等高高检测基因分子杂交专一PCR随机PCR专一PCR随机PCR检测基因组部位单/低拷贝区基因组基因组基因组基因组实用技术难度难易易易易DNA质量要求高低低低低DNA用量510 ng50 ng50 ng50 ng50 ng是否使用同位素是否否否否探针DNA短片段专一引物随机引物专一引物随机引物费用中等高低高低1.3.3 本实验所选取的分子标记：SSR和ISSR分子标记概述1）SSR （ Simple Sequence Repeat ） 简单序列重复，微卫星DNA微卫星DNA，是普遍存在于真核生物基因组中的以16个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列。这种序列在几乎所有真核生物的基因组中都存在且含量丰富，呈随机性均匀分布。微卫星包括核心序列和两侧的保守侧翼序列。微卫星通过保守的侧翼序列特异地定位于染色体某一区域，而微卫星的高度多态性是由核心序列重复数的差异形成的，这种多态性的信息含量是比较丰富的。该技术通过检查基因组DNA重复序列的差异进行多态性比较，相同植物在不同环境条件下表现型不同，该方法不会受植物组织、器官种类和环境条件等因素的影响。近年来，微卫星作为一种较成熟的分子标记，常被用来进行种群亲缘关系和进化生物学等方面的研究，广泛地应用于遗传连锁图谱、系统发生、种群遗传多样性、生物杂交育种等研究领域（Goldstein D.B. and Pollock D.D.， 1997）。2）ISSR简单序列重复区间扩增多态性ISSR（Inter-simple sequence repeat）是由Zietkiwicz（Zietkiewicz E.，et al，1994）等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。其分子生物学基础是基因组中普遍存在的简单序列（simple sequence repeat ， 简称SSR），且具有与SSR一样丰富的多态性。ISSR技术是在SSR序列的5 或3 末端加上24个随机选择的核苷酸作为引物，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，避免引物在基因组上的滑动，可以提高PCR扩增反应的专一性。以锚定SSR寡聚核苷酸为引物，以位于反向排列于SSR之间的DNA序列为基础，进行PCR扩增，用1722个碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段，而不是扩增SSR本身，其在引物设计上不需知道DNA序列，比SSR技术简单得多，又可以提示比RAPD、SSR更丰富的多态性。1.4研究内容和技术路线 随着全球经济发展的不断加快，石化能源的大量消耗导致环境污染、全球气候逐渐恶化等问题的出现，研究、发现和利用更为清洁、环保的生物质能源无疑具有极其重要的意义（李剑泉等， 2010）。在国内生物质研究领域中，黄连木在出油率、地域分布、适应性等方面较其他植物都表现出了较高的优越性，其种子含油率高、出油率高，特别是油酸的含量高，成为生物柴油的优质原料（陈金波，2009）。物种的遗传多样性是其赖以生存、发展和进化的基础，遗传多样性越丰富，其适应性进化的潜力就越高，适应环境变化的能力也越强。了解物种遗传多样性水平和遗传变异的空间分布格局对于制定科学的基因资源保护策略具有重要意义，也是动植物育种和遗传改良的理论基础。目前国内对于黄连木的研究主要集中于人工栽培技术、病虫害防治（秦飞等， 2007）、种子含油量（李晓旭等， 2008）等，关于黄连木遗传多样性方面的研究较少。目前报导的仅见王超（2010）应用RAMP分子标记对安徽滁州、北京房山、山西绛县、河南林州、河北武安和四川康定6个地区的种源进行遗传多样性研究。以及吴志庄（2008）用SSR标记对黄连木进行了初步的研究，且其材料来源仅限于河北、河南和陕西三个省。但黄连木分布范围广泛，主要分布在河北、河南、陕西、四川、贵州、云南、浙江、江苏、山东和安徽等省区（侯新村等， 2010）。为了获得更全面的黄连木遗传多样性信息，本研究对黄连木分布的主要地区进行全面采样，利用微卫星分子标记，开展群体遗传多样性分析及亲缘关系研究，并利用居群间的亲缘关系对黄连木进行种源区划，对黄连木种源的调配、种质资源的保护与利用奠定理论基础。技术路线图（Fig.1-1）如下：黄连木分子材料野外采集播种育苗基因组DNA的制备ISSR-PCRSSR-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳检测琼脂糖电泳检测遗传多样性及遗传距离分析遗传多样性及遗传距离分析黄连木遗传多样性及遗传距离分析为黄连木的育种及种源区划奠定基础图1-1技术路线图Fig. 1-1 TechnologyRoadmap基因组DNA的制备2基因组DNA的制备2.1材料2.1.1播种育苗黄连木主要是靠种子繁殖，由于黄连木种子外被蜡层，直接播种发芽比较困难，因此必须事先经过沙藏，播种过程如下：1） 去皮：十月份到野外采集种子，实验室进行去皮处理，种子采集地点见表2。2） 消毒：去皮种子在千分之一KMnO4溶液中浸泡0.5h进行消毒，再用清水冲洗干净。3） 低温沙藏：所用沙子过筛，去除石块，使用千分之一的KMnO4溶液进行消毒，放置晾干备用。将消毒好的种子，按种子和沙1：3混合均匀，维持饱和持水量60，置于花盆中，在苗圃室外低温放置100天。4） 赤霉素处理：沙藏好的种子用100mg/L赤霉素溶液浸泡24h，取出后清洗。5） 播种：在花盆中垫入2/3的土，均匀撒一层种子，覆土2至3厘米，轻轻压实，定期浇水。表2-1播种材料的采集信息Tab. 2-1 Origin of the tested materials居群名称Population Name采集地点collection sites of sample纬度N（）经度E（）海拔（m）样本数Samplesize河北Hebei河北涉县（SX）Shexian，Hebei36.31113.556020云南Yunnan云南保山（BS）Baoshan，Yunnan25.0899.09175918浙江Zhejiang浙江丽水（LS）Lishui，Zhejiang28.29119.511607152.1.2野外采集2008和2009年分别在甘肃、山西、山东、河南、安徽、江苏、四川、湖北、贵州和湖南十个省进行分子样品采集，上述各省的经度范围为103.52E120.18E， 纬度范围为26.19N39.38N，采样地点详细信息见表2-2。每个居群随机取样15-22株，两株间保证相隔距离100m以上，样株生长状况良好，没有明显缺陷，无病虫害干扰。选取各个样树下部的幼嫩叶片作为材料，用变色硅胶干燥保存。表2-2供试材料的采集信息Tab. 2-2 Origin of the tested materials居群名称Population Name采集地点collection sites of sample纬度N（）经度E（）海拔（m）样本数Samplesize湖南Hunan湖南衡南（HN）Hengnan，Hunan26.40112.4295.422河南Henan河南鸡公山（JGS）Jigongshan，Henan31.47114.0532021安徽Anhui安徽采石矶（CSJ）Caishiji，Anhui31.38118.211315山东Shandong山东泰山（TS）Taishan，Shandong36.14117.0669515湖北Hubei湖北秭归（ZG）Zigui，Hubei30.50110.57123016山西Shanxi山西晋城（JC）Jincheng，Shanxi35.32111.0348016四川Sichuan四川平武（PW）Pingwu，Sichuan30.03103.524319江苏Jiangsu江苏无锡（WX）Wuxi，Jiangsu31.33120.1831015甘肃Gansu甘肃舟曲（ZQ）Zhouqu，Gansu33.47104.34180020贵州Guizhou贵州黎平（LP）Liping，Guizhou26.19109.1141020北京Beijing房山区上方山（SFS）Shangfangshan39.38115.52300152.1.3主要仪器Epperdorf金属浴恒温振荡器HealForce台式高速冷冻离心机Epperdorf微量移液器三洋灭菌锅，SIM凝胶成像系统LabTeach紫外分光光度计2.1.4溶液配制1）提取缓冲液:100mM Tris-HCL（PH=8.0），20mM EDTA（PH=8.0），1.4M NaCl，2 CTAB0.5M Tris-HCL（PH=8.0）: Tris6.057g，80ml蒸馏水溶解，HCl调pH至8.0，定容至100ml0.1M EDTA（PH=8.0）:二水乙二胺四乙酸二钠3.74g，溶于80ml蒸馏水，NaOH调PH直8.0，定容至100ml5M NaCl:NaCl 29g，蒸馏水溶解并定容至l00ml配制提取液: 100ml的提取液中，含0.5M Tris-HCl（pH=8.0） 20ml， 0.1M EDTA （PH=8.0） 10ml，5M NaCl 14ml，定容至100ml。2）氯仿-异戊醇（24:1）：取48ml氯仿，加入2ml异戊醇，混匀，4保存备用。3）异丙醇：将异丙醇分装一小瓶，4保存备用。4）75%乙醇：将配制好的75%乙醇分装一小瓶，4保存备用。5）无菌水：将蒸馏水分装一小瓶，高温灭菌，4保存备用。6）TE（100ml）：0.5M Tris-HCL（PH=8.0）2ml，0.1M EDTA（PH=8.0）lml。7）1上样缓冲液98去离子甲酰胺，10Mm EDTA（Ph8.0），0.25二甲苯青，0.25溴酚蓝2.2实验方法2.2.1 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取法1） 用酒精灼烧研钵，室温冷却，取出实验材料，经变色硅胶干燥后的叶片，选取指甲盖大小一块放入研钵中，加入适量PVPP，液氮研磨。2） 迅速将研磨好的细粉装入1.5ml离心管中，加入900L65预热的CTAB提取缓冲液（CTAB 2，EDTA 10mM， Tris-HC1 50mM，NaC1 1.4M， pH8.0），混匀。3） 迅速将离心管置于65水浴中，保温90min，其间不时温和颠倒混匀。4） 待冷至室温后，取出离心管，每管加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）溶液，混匀后至溶液呈乳浊状，12000r/min离心10min。5） 用剪去端部约0.8cm的lml枪头小心将上清液相转移至一干净的1.5ml的离心管中。6） 上清再次加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）溶液，混匀后至溶液呈乳浊状，12000r/min离心10min，取上清。7） 在上清液中加入等体积-20预冷的无水乙醇，轻轻混匀，放到4冰箱中，直至有白色絮状沉淀出现。8） 取出离心管后，12000r/min离心10min沉淀DNA，去上清。9） 用70的乙醇洗3次，然后置于空气中干燥。10）沉淀干燥后，用100L TE溶液重新溶解，4过夜或直接置于-20冰箱中保存。2.2.2基因组提取试剂盒提取法1） 取新鲜植物叶片约100mg或干叶片30mg，加入液氮后充分研磨。2） 取700L GP1缓冲液65预热（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1），将研磨好的粉末迅速转移到装有预热缓冲液的离心管中，颠倒混匀后，在65水浴中温预20分钟，水浴过程中不时颠倒混匀离心管。3） 加入700L氯仿，充分混匀，12000rpm离心5分钟。4） 取上清转入一个新的离心管中，加入700L GP2缓冲液，充分混匀。5） 将混匀的液体分两次转入CB3吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃掉废液。6） 向CB3吸附柱中加入500L GD缓冲液， 12000rpm离心30秒，弃掉废液，将CB3吸附柱重新放入收集管中。7） 向CB3吸附柱中加入700L PW缓冲液， 12000rpm离心30秒，弃掉废液，将CB3吸附柱放入收集管中。8） 向CB3吸附柱中加入500L PW缓冲液， 12000rpm离心30秒，弃掉废液。9） 将CB3吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，弃掉废液。将CB3吸附柱室温放置5分钟，彻底晾干材料中残余的漂洗液，防治干扰后续试验。10）向吸附膜的中间部位悬空滴加100L洗脱缓冲液TE，然后将CB3吸附柱转入一个干净的离心管中，室温放置2-5分钟，使DNA重复溶解，12000rpm离心2分钟。11）离心得到的溶液二次加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000r