浅谈端粒和端粒酶的研究和应用-医学论文.doc

浅谈端粒和端粒酶的研究和应用-医学论文早在30年代,两名遗传学家Muller和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要,Muller将这一结构命名为端粒(telomere).直到1985年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简单的6个核苷酸TTAGGG序列的多次重复后发现了端粒酶(telomerase TRAP-eze) . 端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点.端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸-蛋白复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性.端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳定性.许多研究表明,端粒,端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为,包括细胞周期的稳定性,细胞增殖,癌变,凋亡,衰老. 摘要：古往今来，“长生不老”成为人们一直追求的梦想，曾经有多少人用各种方法来延缓衰老，但终未取得显著效果。近年来研究证实，端粒缩短导致衰老。本文就端粒、端粒酶与衰老的关系做一综述。 关键词：端粒、端粒酶、衰老 最早观察染色体末端的科学家始于19世纪末期，Rabl1在1885年注意到染色体上所有的末端都处于细胞核的一侧。20世纪30年代，两个著名的遗传学家McClintock B 2和Muller HJ 3发现了染色体的末端可维持染色体的稳定性和完整性。Muller将它定义为“telomere”，这是由希腊词根“末端”（telos）及“部分”（meros）组成的。30多年前，Hayflick4首次提出将体外培养的正常人成纤维细胞的“有限复制力”作为细胞衰老的表征。在此过程中，细胞群中的大部分细胞经历了一定次数的分裂后便停止了，但它们并没有死亡，仍保持着代谢活性，只是在基因表达方式上有一定的改变。于是Hayflick猜测细胞内有一个限制细胞分裂次数的“钟”，后来通过细胞核移植实验发现，这种“钟”在细胞核的染色体末端端粒。但端粒究竟是怎样的复杂结构呢？Blackburn和Gall5 于1978年首次阐明了四膜虫rDNA分子的末端结构，他们发现这种rDNA每条链的末端均含有大量的重复片段，并且这些大量重复的片段多是由富含G、C的脱氧核苷酸形成的简单序列串联而成。在1985年，CWGreider和EHBlackburn发现将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这就说明了确实有这样的一种酶存在6，并将它命名为“端粒酶”（telomerase）。之后，耶鲁大学Morin于1989年在人宫颈癌细胞中也发现了人端粒酶7 。近年来，随着人体端粒酶的发现和端粒学说的提出，已经知道决定细胞衰老的“生物钟”就是染色体末端的端粒DNA，它可随着年龄的增长而缩短。 一、衰老机理及假说 许多人错误的认为，退休是一个人进入生理老年的开端。而老年则是衰老的标志，其实，这是不科学的。人体的所有器官和组织都由细胞组成，但组成器官和组织的细胞有两大类，即干细胞和非干细胞。人体衰老正是由细胞特别是干细胞衰老引起的。医学家认为，如果人类若能避免一些疾患和意外事故，人类寿命的上限应当是130岁。在人类基因组计划之前和进行之中，对长寿的分子生物学研究就有了许多显著的成果与发现。总的归纳起来便是：衰老是一种多基因的复合调控过程，表现为染色体端粒长度的改变、DNA损伤（包括单链和双链的断裂）、DNA的甲基化和细胞的氧化损害等。这些因素的综合作用，才造成了寿命的长短。 近几十年来，随着现代遗传学、分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等边缘学科的飞速发展，人们对衰老的机理有了深层次的认识，有许多学说如遗传程序学说、DNA分子修复能力下降假说、体细胞突变学说、差错灾难学说和交联学说等已经被人们广泛接受，但端粒学说刚进入人们的研究范围。端粒缩短可引起衰老，而维持端粒长短的重要活性物质便是端粒酶。生物学家早就发现一件有趣的事实：就是每一种细胞的寿命都有一定限度，在人工培养条件下，接近这个限度时，哪怕用最好的培养方法都拯救不了既定的命运。像人体的成纤维细胞，据试验，最多只能繁殖50代，到那时必然趋于死亡。其他像老鼠的成纤维细胞只能分裂18代，龟的成纤维细胞分裂110代，如此等等。那么人为什么会衰老，以至走向死亡呢？有研究者对导致人体细胞衰老的原因提出了“程序假说”和“错误积累假说”。 人类的细胞并不能无限制地重复分裂，在分裂5060次后便会停止。细胞不再继续分裂的机体组织，便呈现出衰老和机能低下的状态。随着细胞重复分裂使端粒缩短到一定的长度，从而使细胞停止了分裂。这就是“程序假说”。 细胞分裂的时候，DNA被复制，但是由于X射线、紫外线、活性氧、有害物质的损害，DNA会发生异常变化，于是DNA在复制过程中就会产生错误。随着错误的积累，生成了异常蛋白质，细胞机能变得低下，于是细胞便不能继续分裂，呈现出了衰老迹象。这就是所谓“错误积累假说”。 因此，人不像机器那样容易磨损和坏掉，而是能自我成长和修复，但这只能算是衰老的伴生现象。对衰老机理的研究就是为了有效地指导抗衰老的研究和实践工作。但是，人类衰老的原因是多方面的，衰老的机理也是极为复杂的。 二、端粒和端粒酶 端粒是真核细胞内染色体末端的DNA重复片断，经常被比做鞋带两端防止磨损的塑料套，由富含G的核酸重复序列和许多蛋白质组成，包括Ku70、Ku80、依赖DNA的蛋白激酶和端粒重复序列结合因子2（TRF2）等。不同个体的端粒初始长度差异很大，在人中大约为15 kb，在大鼠中可长达150 kb，在小鼠中一般在580 kb之间变化，而在尖毛虫中却只有20 bp。在所有的有机体中，端粒DNA的长度总是随着外界环境而波动变化的。酵母的端粒DNA在200400 bp间随遗传或营养状态的改变而改变，四膜虫和锥虫等有机体的端粒长度在对数期会持续增加。相反，在人体中，随着细胞的持续分裂，端粒会缓慢缩短。细胞培养研究表明，当端粒再也无法保护染色体免受伤害时，细胞就会停止分裂，或者变得不稳定。其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体免遭融合、重组和降解。染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。 端粒酶（或端粒体酶）是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，其含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化8。如果细胞被病毒感染，或者某些抑癌基因如p53、pRB等突变，细胞可越过M1期而继续分裂,端粒继续缩短，最终达到一个关键阈值，细胞进入第二致死期M2，这时染色体可能出现形态异常，某些细胞由于端粒太短而失去功能，从而导致细胞死亡。但极少数细胞能在此阶段进一步激活端粒酶，使端粒功能得以恢复，并维持染色体的稳定性，从而避免死亡。最近Shay et al9在Science上发表了一幅有趣的模式图，简要介绍了端粒、端粒酶介导细胞凋亡或永生化的过程。 大量的证据表明，端粒酶的激活或抑制会导致细胞永生化或进入分裂终止期。端粒酶在超过80%的永生细胞系及大多数肿瘤组织中呈激活状态。端粒酶的抑制会使胚胎干细胞、骨髓造血细胞的增生受到抑制,并使肿瘤细胞系增生减弱，以致于凋亡增加。有必要指出的是：端粒酶对细胞增生、衰老及凋亡的调节是通过不同的途径进行的。其中端粒延长依赖性机制作用缓慢，需要多代细胞端粒的进行性缩短积累到一定程度，才会诱发细胞静止信号的激活。最近有一种端粒延长非依赖性机制，其作用较快，可能涉及到端粒三级结构的改变，蛋白相互作用的改变,转位的改变等10。三、端粒及端粒酶与衰老的关系 关于端粒丢失同衰老的关系理论是由Olovnikov博士于1973年首次提出的11。他认为，端粒的丢失很可能是因为某种与端粒相关的基因发生了致死性的缺失。目前认为，人类细胞内端粒酶活性的缺失将导致端粒缩短，每次丢失50200个碱基，这种缩短使得端粒最终不能被细胞识别。端粒一旦短于“关键长度”，就很有可能导致染色体双链的断裂，并激活细胞自身的检验系统，从而使细胞进入M1期死亡状态。随着端粒的进一步丢失，将会发生染色体重排和非整倍体染色体的形成等错误，这将导致进一步的危机产生，即M2期死亡状态。当几千个碱基的端粒DNA丢失后，细胞就停止分裂而引起衰老。端粒及端粒酶涉及衰老最有力的证据是Bodnar12等证实的。如果细胞试图要维持其正常分裂，那么就必须阻止端粒的进一步丢失，并且激活端粒酶。Cooke13等认为，由于人体细胞中的端粒酶未被活化，从而导致了端粒DNA缩短。因此，只有那些重新获得端粒酶活性的细胞才能继续生存下去，对于那些无法激活端粒酶的细胞将只能面临趋向衰老的结果。研究人员最近还发现，患有一种可加速衰老的遗传病人具有异常短的端粒，这进一步表明端粒在衰老过程中所起的重要作用。在人类细胞中，研究者还发现，端粒缩短的速率与细胞抗氧化损伤的能力相关。更容易遭受氧化损害的细胞，其端粒缩短更快，然而那些更能抵抗这种损伤的细胞，端粒缩短得较慢。如果能减免细胞损伤或激活端粒酶，即可控制人类的衰老进程。 有人曾经对人淋巴细胞的衰老性变化与其端粒长度以及端粒酶活性的关系在各种体内体外环境及处理因素下做了观测，发现端粒酶活性和端粒长度的调节有可能是淋巴细胞增殖的控制因素，这已在人体淋巴细胞的发育、分化、激活和衰老过程中被验证。曾发现外周血CD+4T细胞的端粒长度在体内随着衰老以及从静息细胞到记忆细胞的分化过程而缩短，在体外则随着细胞的分裂而缩短，这些结果提示端粒长度与淋巴细胞增殖过程以及记忆性增殖潜力相关。 端粒酶的表达已知能够抑制衰老，而Weinberg and colleagues14认为端粒酶的作用主要在于延长了端粒悬垂的长度。细胞的复制期限被认为由最终导致衰老的两个机制决定，一个是累积的DNA损伤，另外一个是端粒的进行性缩短。Weinberg and colleagues研究了一个端粒的特殊悬垂结构在衰老过程中的作用，悬垂结构只在富含C的末端之外还有一个由几百个核苷酸组成的富含G的结构。据称Shay实验小组15的研究策略是通过抑制端粒酶活性，从而迫使永生化细胞转变为正常细胞，进入正常的衰老和死亡模式。 在衰老异常发展中有一种早衰人群，即从20岁开始皮肤和毛发等便迅速衰老，其原因仍在于制造端粒酶的遗传基因。细胞在分裂的时候，DNA双螺旋结构以其一根长链为“模子”进行DNA复制。在DNA修复损伤的时候，“拆解”DNA的双螺旋结构是必要的，制造端粒酶的遗传基因在解开DNA螺旋结构上起作用。像制造端粒酶并从事DNA复制和修改错误的一类遗传基因，若与延长细胞寿命的端粒酶良好结合，我们也许能期待向“长生不老”的目标进一步接近。 四、展望和未来 总之，人类体细胞在复制衰老过程中产生的端粒丢失现象已在体外得到了证实，而且体内的端粒丢失可作为判断供体年龄的依据。我们只要设法使已衰老的人体内各种干细胞的端粒长度恢复到年轻时的水平，老人就会返老还童和长生不老。但在人类端粒及端粒酶的基础研究中，还存在着许多难点，如：人端粒末端的精细结构，端粒的非端粒酶延伸机制；人端粒酶的具体结构及其基因所在的位置；端粒酶的激活机制及其活性调节等，均有待于回答。尽管如此，我们似乎仍看到了前景的美好。毕竟人们已找到了同衰老有着紧密相关性的因素端粒和端粒酶。人们对于端粒抑制剂的研究已经蓬勃的展开了。故进一步研究端粒酶的活性调节机制，对于开发新型延缓衰老的端粒酶抑制剂无疑具有重要意义。Colorado大学的两位研究人员Thomas Cech 和Robert Weinbrg16博士已独立地克隆出一种控制人类细胞端粒酶活性的基因。应用这种基因，很有可能得到一种新的蛋白质端粒酶的控制剂。 关于衰老机理和抗衰老的研究领域现在仍然是非常活跃的，并将受到越来越足够的重视，因为它对于延缓衰老，实验老年医学研究的目的即防止人类早衰，保持人体健康长寿是极为重要的。但是，就目前人类在这方面的研究来看还很薄弱。在今后一个时期内，有关衰老与抗衰老的研究重点还应放在以最新生物学技术研究有关长寿与衰老基因的克隆、结构分析以及对这些基因的调控机制；机体衰老过程中自由基、突变以及其它有害刺激因素启动细胞衰老凋亡的分子机制和这些过程被调控的分子机理；利用衰老基因与长寿基因的研究成果进行的基因治疗方面研究等。 参考文献 1.Rabl.C Uber Zelltheilung Morphologisches Jahrbuch 1885;10;214-330. 2.McClintock B.The stability of broken end of chromosome in Zea mays. 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fusion)以及染色体的丧失,同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体.在生理情况下,端粒作为细胞分裂时钟能缩短,最终导致细胞脱离细胞周期. 二,端粒酶的结构与功能 在端粒被发现以前,人们就推测生殖细胞之所以能世代相传,其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制,体细胞可能正是由于缺乏这种机制,它的染色体末端才面临着致死性缺失(deletion)的危险.因此在正常人体细胞间永生化细胞(immortalized cells)及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制.这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢 科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短,但也会被新合成的端粒片断再延长.科学家们怀疑,可能尚有末被发现的酶,该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功能,能使已缩短的端粒延长,使科学家们兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶端粒酶的存在. 一 端粒酶的结构端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶.它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸.端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶(TERT)端粒酶结合蛋白(TEP) 端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶(TERT)端粒酶结合蛋白(TEP)端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶组分.端粒酶RNA含有与同源端粒DNA序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H切割此模板区,能使体外消除端粒酶延长端粒的功能.人类TERT(hTERT)基因为一单拷贝基因,定位于5p15. 33 ,具有7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T.破坏TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短.TEP1,生存动力神经细胞基因(SMN) 产物, hsp90 , PinX1, Est1p 和Est3p 1,端粒酶RNA(hTERT) 哺乳动物端粒酶RNAs(hTR和mTR)在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达.体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要,影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度,并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 .端粒酶RNA转录模板远端区参与和底物的结合.近端区能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要.模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku 结合.2,端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT) 几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT 基因, 哺乳动物TERT 的转录由许多转录因子,激素和细胞外信号严格控制.不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达.癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因, 并可与H-Ras,N-Ras,多瘤病毒MT,LT 等癌基因协同作用, 促进细胞无限增殖, 获得永生化并发生癌变.c-myc 与hTERT Fujimoto等用c-myc 反义寡核甘酸转染白血病细胞后, 这些细胞中端粒酶活性均能被下调, 而c-myc 正义寡核甘酸无此作用.Wang等研究发现c-myc在正常人乳腺上皮细胞和二倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性, 并能延长这些细胞的寿命.因此认为癌基因c-myc为一重要的端粒酶激活剂.存在于hTERT核心启动子中有两个重要的c-myc 结合位点(CACGTG,亦被称为E 盒).c-myc 诱导的hTERT 表达起始速度快,不受细胞增殖或额外的蛋白合成的影响,与c-myc 引起的直接的转录激活一致.但癌基因c-myc 不是唯一与hTERT基因调节有关的转录因子.近期研究表明,Sp1 协同c-myc 激活hTERT的转录,可能还有其他因子,如Bcl-2 抗凋亡基因,E6HPV16 型蛋白,以及经过一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT 上调.但在诸多不同类型的瘤细胞中,致hTERT上调的基本激活剂是c-myc.TERT内的N-残基对多种功能是重要的, 包括与端粒酶RNA结合,端粒酶RNA 装配和催化作用,与p53 的相互作用和细胞永生化.TERT的C-残基也在人类原始纤维母细胞的永生化,端粒组装的竞争,核仁内定位,引物结合和渐进性延长等方面起重要作用. 3,端粒酶相关蛋白(TEP) 端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白,TEP1 缺失导致rRNA 水平的显著降低以及TEP1 和rRNA 的丢失,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱. 生存动力神经细胞基因(SMN) 产物热休克蛋白(hsp)90 ,其他涉及到TERT转录后修饰的蛋白包括磷酸酶-A,Akt ,cAbl ,p53 和PARP.PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性. 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关.Est1p 足以使端粒延长.但是,在无Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端粒长度.二 端粒酶的功能端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶,它可以维持端粒的长度,维持细胞增殖潜能.端粒酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列,具有逆转录酶活性,它的活性不依赖于DNA聚合酶,对RNA酶,蛋白酶和高温均敏感.端粒酶活性表达能稳定端粒的长度,抑制细胞的衰老,在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性.在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNA合成.体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程:受双链端粒结合蛋白包括RAP1 (芽殖酵母) ,存在于t环的TRF1 (依赖于端粒酶)和TRF2(不依赖于端粒酶)的负调控. 第二节 端粒-端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响_端粒-端粒酶假说认为端粒酶的激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生,发展密切相关.染色体末端的端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件.相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永生化和癌症发展必需的一步.目前的资料证实,端粒酶对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的. 细胞的死亡过程分为两个阶段, 当端粒缩短至一关键性长度2kb-4kb 时,染色体的稳定性就会遭到破坏,细胞开始衰老进入M1期(mortality stage1 M1).在M1期细胞对生长因子等失去反应,产生DNA合成蛋白抑制因子,细胞周期检查点(cell cycle checkpoints)发送周期停止信号,DNA合成停止,DNA 断裂,活化p53 依赖或非p53 依赖的DNA 损伤途径.并诱导细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制物如p21 ,p27产生,导致细胞G1期生长停滞,最终走向死亡.如果这一过程中一些癌基因SV40T抗原,PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活,丧失正常功能, 均能使M1期的机制被抑制使细胞逃逸M1期,继续生长获得额外的增殖能力,此时端粒酶仍为阴性,端粒继续缩短,经过20-30次分裂后,最终到达M2期.细胞由于端粒过短,基因不稳定,绝大多数细胞死亡,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活,端粒的功能得到恢复,基因重获稳定,使细胞超越M2期,成为永生化细胞. 端粒酶被抑制正常人体细胞端粒丢失M1期阻滞 SV40T抗原细胞分裂停止 Rb,P53与病毒蛋白结合,突变M1M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化染色体失稳 端粒酶被激活细胞凋亡 端粒酶在人体细胞永生性转化中第三节 端粒酶细胞周期中细胞增殖,凋亡的影响 一,端粒酶对细胞周期的影响端粒酶活性与细胞周期密切相关.细胞周期所处阶段不同,端粒酶活性亦不同, 端粒酶活性与细胞周期CDK-CKIs 网络调控系统有关 .实验发现永生化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而静息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入G1/S 期,端粒酶活性逐渐升高,在复制S 期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无血清而进入G0 期时,端粒酶活性不受影响.在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD 或cyclin E 的高表达,某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调控.各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链破坏时可使野生型p53活化, 进而引起细胞周期停滞或诱导细胞凋亡, 使细胞得以避免表型恶性转化.端粒双链DNA 的破坏是否也能活化p53依赖的信号传导通路呢 kusumoto等在构建的端粒酶和p53单或双缺陷鼠体内研究证实, 端粒DNA的丢失可以诱导活化p53和p21WAF1, 并导致细胞周期停滞,而p53的缺失则可促进端粒序列的丢失, 增大染色体的融合频率.端粒功能的缺失以及相继出现的基因不稳定与p 53缺陷相协同而激活细胞恶性转化过程.二,端粒酶对细胞增殖的影响曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志,然而,不但在正常组织的永生化细胞(如造血干细胞,精子) ,而且在非永生的,正常生理状态下增殖活跃的细胞(如受抗原刺激的T及B淋巴细胞,口腔和食道粘膜上皮,皮肤基底层角质形成细胞,宫颈上皮,小肠上皮) 也可检出端粒酶活性.但Lehner 等用定量RT-PCR 法在子宫内膜癌,增生期子宫内膜,分泌期子宫内膜及萎缩性子宫内膜检测到hTERT mRNA 表达值差异显著.可见,不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性,但其程度不同.因此,借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖,其意义明显不如定量检测.已有多次报道:改变实验条件可使多种端粒酶活性阴性细胞表达端粒酶活性,并获得永生;反之,抑制某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖.另有人发现:端粒酶通过调节端粒长度和生长促进因子基因表达来影响细胞增殖 .提示端粒酶是细胞生长,增殖中的重要机制.但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤虽然没有端粒酶活性,但仍有较长端粒,提示还存在不依赖端粒酶的端粒延长机制 .此外用识别hTR 3端不同序列的三种核酶作用于肿瘤细胞,4周内端粒酶活性降低,端粒缩短,增殖速度没有改变.其他研究如黑素瘤细胞,8周内端粒酶活性降低,但是传代超过20 代后,端粒长度不缩短,细胞持续增殖.说明除了端粒,端粒酶引起细胞增殖的作用外,还有其他引起细胞的增殖机制.三, 端粒酶对细胞凋亡的影响启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近, 完整的端粒结构可以抑制这些基因的表达, 而维持端粒长度主要依赖于端粒酶.Holt等在实验中发现, 通过异位表达端粒酶,而使端粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强; 用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长, 子代细胞生存和抗凋亡能力将增强;端粒酶阳性永生化细胞要比端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力.这些与两个主要的凋亡途径核内钙依赖核酸内切酶诱导途径和Caspese家族中IL-1B转换酶活化途径存在缺陷有关.此外, 研究发现诱导hTERT 显性突变,降低肿瘤细胞内源性端粒酶活性, 肿瘤细胞端粒将持续缩短, 继之异常有丝分裂增多, 并最终出现大量凋亡细胞.第四节 端粒酶与衰老如何使人体衰老延迟,一直都是人类所不断追求的.虽然科学家们发现了一些抗衰老的药物和方法,但都不够理想.细胞经过一定次数分裂后,端粒的不断丢失使细胞就进入不可逆转的生长抑制状态,脱离了细胞周期而衰老,凋亡,此过程即为复制性衰老.在体外培养中,衰老细胞逐渐增多的过程中,可用端粒序列的逐渐丢失来作衰老量化机制精确模型.随着年龄增长,染色体中端粒长度缩短.在早老患者中有一个过早的端粒缩短,进而缩短的端粒允许染色体融合,这些现象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关.既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度,使端粒在细胞复制过程中不会丢失,细胞衰老的进程也能被阻止,从而寿命延长这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系的新热点.端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早的证据来自Bodnar等的研究,1998年其在Science上刊文报道:将人的端粒酶基因导入端粒酶阴性的正常人体细胞中激活其表达并培养细胞,然后与未导入该基因的细胞比较,发现前者端粒明显增长,细胞分裂旺盛,细胞寿命比后者大大延长,更令人关注的是细胞并无肿瘤样改变.Kudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志.Mattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与TERT功能,能较好地避免神经细胞死亡,还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复.阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病,其患者的脑血管壁中可分离出致AD神经元退行性病变的 -淀粉样蛋白.Zhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中TERT的功能抑制,发现显著增加了由 -淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡;嗜铬细胞瘤细胞中TERT的过量表达会降低此种细胞凋亡. _其原因是TERT功能降低的神经细胞在暴露于 -淀粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障碍,因而引起细胞凋亡.TERT在神经退行性病变实验模型中展现出有神经保护性功能,提示在神经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰老相关的神经退行性病变,如AD和脑老化的发生等.端粒缩短加快可在许多病变中观察到:如Down 综合征,Werner 综合征,毛细管扩张失调症 ,先天性角化不良等,虽然有些遗传异常和端粒缺陷的关系还不清楚,但可能的原因有: 端粒核酸外切酶活性和(或)有效利用的增加.端粒过度丢失.在发育或出生后端粒补偿机制的不足(端粒酶或正性ALT样功能).端粒缩短加速可由于环境的应急介导的DNA 损害或对这些损害敏感度增加所致.不管何种原因,端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征,但也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆过分生长. 第五节 端粒酶活化是肿瘤的显著特征尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式,即端粒替代延长(altematire Lengthening of telomere ALT)机制,但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用.自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来,越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到.美国学者在400多例来源于12 种不同组织的原发肿瘤病例中,肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8%,而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4%.附表 人体组织中端粒酶活性 365/430 (84.8)14/332 (4.2%) 合计 24/26 (92.3) 8/93(8.6%)其它(头顶部,Wilms瘤) 6/8(75%)脑21/23(91.3%)血液(淋巴瘤,CLL ALL) 94/100(94%)0/17(0)神经母细胞瘤 40/55(72.7%)0/55(0)肾7/7(100%)0/8(0)卵巢1/1(100%)肝22/23(95.6%)0/45(0)结肠23/27(85.1%)1/18(5.6%)前列腺19/24(79.6%)2/28(7.1%)乳腺109/136(80.1%)3/68(4.4%)肺肿瘤组织(%)与肿瘤邻近正常组织/良性病变 肿瘤部位/类型 Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果,总结了正常组织(196例),原位癌(410例),恶性肿瘤(2031例)和癌旁组织(690例)的端粒酶的阳性率,它们分别是0.5%,30%,85%和11%.在前列腺癌,乳腺,胰腺,肺,肝的早期癌中端粒酶的阳性率为85.0%95.0%,而对应的癌旁或良性病变组织中,端粒酶基本上不能检出或活性极微弱.Sumida等的研究结果表明,端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为:口腔鳞状细胞癌80 %90%,食道癌87%,胃癌85%,肺癌80.1%,肝癌85%,乳腺癌85%,肾癌71%,胰腺癌95%,端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性. Orlando 等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的流行病学调查,结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率为69%(345/497),正常肾组织为2%(7/344);膀胱癌组织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为72 %(131/182) ,而正常人为9%(47/ 486);前列腺癌组织中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为38%(32/83) ,前列腺上皮瘤为16%(4/25) ,良性前列腺肥大为8%(11/129) .85%90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低.人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果.一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环节.对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制(TMM)的延长,使初期细胞突破衰老屏障后癌变.发生的原因,最可能为过度的端粒酶激活或ALT样功能在在细胞癌变中端粒长度的保留或增加,允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展.一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途经维持端粒的长度.端粒酶或ALT机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度.在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象,可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短,导致异常修复事件使染色体发生端端融合.端端融合的后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂,进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性. 美国学者在CML和AML的端粒动力学研究中,用southern印迹法测量端粒长度,用stretch-PCR法测出端粒酶活性,在CML白细胞中,端粒酶活性非常低与正常组织相似.但若CML急性发作时,白细胞中端粒酶活性就表现为显著升高.表明CML由慢性到急性发作时,高度激活了端粒酶.通过对CML和AML病情进展研究,发现所有病例中肿瘤细胞的端粒与相应正常细胞相比都是缩短的,这可能是由于肿瘤细胞分裂次数远远大于正常细胞之故.端粒危机有些实体肿瘤细胞中端粒酶激活,但端粒并末缩短而是延长出现了矛盾的现象,被称之为端粒危机(端粒缩短和端粒酶激活).这是肿瘤细胞克隆繁衍的强大驱动力,促进肿瘤的发展.端粒危机的 假说的可能解释为:许多血液学的恶性肿瘤都不会在局部形成肿瘤,细胞的增殖和循环都是单细胞的,因此每一个白血病细胞都将竞争更有效的增殖,使突变细胞在短期内形成群落.与此相反实体肿瘤位于一点而不移动,因此子代对于不同突变的竞争被其紧邻所限制.实体肿瘤中大多数成功的克隆将比白血病细胞有更稳定的遗传特性.因为位于特殊环境中的特殊表型必须保持相当长的时间才能克隆形成群落,所以实体肿瘤只有具备较长的端粒,才能有较稳定的遗传特性,具备最好的表型从而被选择,进而生长繁殖.端粒酶水平与某些肿瘤恶性程度相关.采用端粒重复放大测定法(telomeric repeat amplification protocol ,TRAP) 检测膀胱癌患者尿液中端粒酶的活性,期肿瘤患者端粒酶阳性率为79 %(包括15 例细胞学检测阴性患者) , 期和期肿瘤患者端粒酶阳性率分别为84%及87.5 %; 66%的膀胱炎患者端粒酶阴性,其