分子生物学总结.docVIP

一、5 race: 在反转录酶的作用下，用已知基因片段内部特异性因为起始cDNA第一条链合成。RNase混合物降解模板mRNA,纯化cDNA第一条链的合成。用末端转移酶在cDNA3端加入dCTP,形成oligodC尾巴。以连有olifodC的锚定引物和基因片段内部特意的nested引物进行PCR，得到目的片段，并用nest PCR检测3 race:在反转录酶的作用下，以连有可以与mRNA3多核苷酸尾配对的oligodT的锚定引物AP起始cDNA第一条链的合成。用RNase降解模板mRNA. 用锚定引物AP和基因片段内部特异性引物GSP进行PCR扩增，得到目的基因3端片段，并进行检测。作用：cDNA上克隆5或3端缺失序列，二、差视分析法RAD：在没有探针的情况下，发挥PCR能以指数形式扩曾双链DNA模板，且仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过减低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。三、gateway: 阐明大量编码基因的功能时，要通过高效的对载体和宿主没有依赖性的克隆系统。Gateway就是利用纳姆达噬菌体进行位点特异性DNA片段从组，实现了基因快速克隆和载体间平行转移。通过TOPO反应，将PCR得到的目的基因连入Entry载体；通过LR反应，用位点特异性重组将目的基因从Entry载体连入表达载体。四、图位克隆：将具有某种表现性的基因通过此方法克隆得到。五、双向电泳：第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，达到各自等电点；第二向进行分子量的分离。 第一节：基因表达研究技术一、基因芯片技术：利用互补碱基分子杂交，样品与芯片上的探针特异性相互作用来获得所需信息。可测在不同组织，或者统一组织不同发育期，或不同生理条件下，基因的表达水平。用于基因表达检测、突变检测、基因组多态型分析、基因文库作图。高通量，成本低。二、SAGE:通过测定来自本3端短序列标签来定量分析全基因组表达模式的技术。构建基因表达谱，分析快速详细，可能发现新基因。但不能测量基因的真实表达水平三、RNA-seq：提取mRNA,反转录成cDNA，测序，序列和基因组序列比较，测到的次数越多，说明表达水平越高，如果达到足够多的数据，就可以覆盖整个转录组。不需要参考基因组序列，不需要克隆，精确揭示转录边界和外显子连接方式。九、RNA选择性剪接：用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的剪接异构体 包含外显子遗漏性剪接、内含子保留剪接、5端选择性剪接，3端选择性剪接，内含子保留剪接与细胞生理，发育调节，肿瘤发生，转移有关四、原位杂交技术，用标记的核酸探针，在组织、细胞上对核酸进行精确定位或者相对定量的技术。荧光原位杂交技术FISH：对核苷酸探针做特殊的修饰，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置，得到排列顺序五、基因定点突变技术：使DNA分子上特定位点核苷酸序列发生改变。调控基因：突变与基因结构、功能的关系编码基因：氨基酸残基改变对蛋白质结构、催化活性、结合配体的影响 突变类型：寡核苷酸介导的基因突变，盒式突变，PCR介导：重叠延伸技术，大引物诱导重叠延伸技术：采用具有互补末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，在体外进行有效的基因重组大引物诱导：在DNA模板中部想要制造突变的位置设计一个引物，这个引物跟模板末端的引物配合，这样PCR的结果便是不完整双链DNA，变性后，两条单链便是“大引物”了，而且是带有突变的。用这俩个单链作为引物再进行PCR，便可以得到大量带有目的突变的DNA了。突变率高，双链DNA任何位置都能引入突变，快速简便，使试管里完成所有反应。第二节 基因敲除技术功能丧失：动植物基因敲除、同源重组、T-DNA插入失活、RNAi功能获得：基因过表达一、1.动物敲除：外源DNA与内源重组，将重组载体中的DNA整合到内源基因组中并表达2.植物敲除：T-DNA插入失活：TDNA（来自Ti质粒）能通过根癌农杆菌随机插入到植物基因组中，基因中断，影响编码的蛋白质，引起该基因失活。3.RNAi：利用双链小RNA高效、特异地降解细胞内同源mRNA，阻断靶基因表达，引起基因表达沉默。二、过量表达：冗余基因敲除，表型不明显。敲除基因致死第三节 蛋白质，DNA相互作用蛋白质蛋白质：酵母双杂，荧光共振能量转移法，免疫共沉淀技术，GST融合蛋白沉降技术，噬菌体展示技术蛋白质DNA：酵母单杂，凝胶滞缓，DNA酶足迹1.酵母双杂：将检测蛋白结合到AD上，诱饵蛋白结合到BD上，