Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南.doc

Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南（破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA）1 试剂：三氯甲烷（氯仿），异丙醇，75乙醇，无RNase的水、Trizol reagent 2 材料与仪器：EP管 匀浆器 移液枪 漩涡振荡器 低温高速冷冻离心机 冰袋 电泳仪 琼脂糖凝胶 超净工作台3 操作步骤：3.1 准备工作 A 玻璃匀浆器、75乙醇预冷 ，离心机预冷至4 打开超净工作台紫外灯15分钟以上 B 用酒精擦拭台面 EP管标记 3.2. 匀浆处理 1 取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm ，离心5min，弃上清a 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.（离心取细胞，每5-10106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理）2 1ml Trizol Reagent，震荡混匀3. 将匀浆样品在15-30放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。4. 可选步骤:4 12 000rpm离心10min，取上清。如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。5. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。6. 4 12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）7. 在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20 放置20-30min。（植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。）8 4 12 000rpm离心10min，去上清。（离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。）9 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来，每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。10 4 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。11 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50度保温1小时。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100 的去离子甲酰胺。溶解，-70保存。可以分装保存，防止污染，12 取1ul+1ul buffer 电泳检测RNA完整性，稀释一定倍数，分光光度计测定纯度和浓度。注意事项：1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 一个星期或-20 一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 长期保存。预防RNase污染，应注意以下几个方面：1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片 100-200ug/g叶片动物组织 200-400ug/g肝脏组织动植物培养细胞 5-10ug/106细胞大肠杆菌 2-10ug/mlDH5过夜菌血液 3-5ug/ml人全血问题指南：低得率A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65A. 检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下A280会较高。B. 样品匀浆时加的试剂量太少。C. 匀浆后样品未在室温放置5min。D. 水相中混有有机相。E. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 样品或提取的RNA沉淀保存于-5-20，未在-60-70保存。C. 细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。E. 电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。DNA污染A. 样品匀浆时加的试剂体积太少。B. 样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。 蛋白和多糖污染A. 样品中蛋白、多糖含量高。B. 样品量太大。C. 水相中混有有机相。D. 第6步中加入RNA助沉剂可以帮助去除这些污染。RNA提取一般步骤总结RNA提取原理： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。实验步骤：破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA。1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入-ME可以抑制RNA酶活性。2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。4、 洗涤RNA使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。5、 融解RNA一般使用TE。6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于- 70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000g离心5分钟。RNA提取实验经验心得总结一：实验的准备实验之前必须先准备好相关的试剂和实验用品1 试剂：.TRIZOL,一步法提取用的，最好是INVITROGENE的，ml850RMB,不过也有国产的，便宜些这个试剂是非常关键的，也是不能省的，经常有很多朋友不想买这个，嫌贵，个人感觉是非买不可，不然用其他办法自己配的话也不便宜，而且配的过程中很毒2.异丙醇，无水乙醇，三氯甲烷（氯仿），.逆转录酶等一般如果做的次数不是很多的话可以买试剂盒的，里面什么都有，的也不是很贵，记得是次的多但是如果实验室做得比较多的话，还是自己分开买的比较好逆转录酶个人觉得的最好，而且不贵，其他公司我用得也不多，反正一直用，还有，oligod(T)n,RNA酶抑制剂，除了逆转录酶买的，其他的几样我都是买的的，因为promega的其他几样都很贵，这样配起来用一点也不比原装的差当然实验室比较富裕的也可以买好的，不过话说回来，咱们花的经费大多数还是民脂民膏，这些不太关键的地方省着点比较好（我是不是太罗嗦了！）.用具各种大小的枪头和管。由于RNA提取过程中对于RNA酶是非常敏感的，所以枪头和管子都要做灭酶处理。灭酶的正常程序是用加入DEPC 的水泡枪头和管子，过夜。DEPC的浓度是0.1%。DEPC是强致癌物，做的时候要戴手套口罩，作好防护措施。泡好后再高压，烘干。灭酶除了用DEPC处理外，还可以用氯仿泡枪头和管子，不用泡过夜，1-2小时就行，也没有DEPC那么恐怖，泡后也是高压烘干。5. 水。实验用的水也是很关键的，必须用DEPC处理灭过酶的水才可以。具体做法是将去离子水中加入0.1%DEPC，摇过夜，之后再高压。高压这步是不能省的，因为必须用高压把残留的DEPC分解掉，不然会影响后续的反应。二实验步骤TRIZOL提取RNA的原理就是利用变性剂将细胞裂解，释放出蛋白质，DNA，RNA，之后根据它们在不同PH值和不同极性溶剂中溶解度不一样。而把RNA提取出来。详细的原理可以自己查一查，在这里不做赘述。1. 样品处理 对于组织样品，书上说的办法是匀浆后加TRIZOL，但是我的经验是用匀浆器匀浆的话很多组织都是沾在匀浆器的壁上了，所以我一般都是用小剪刀剪，剪的时候要耐心，剪得很碎才行。一般样品其始量大概黄豆那么大一坨就行了，加1mlTRIZOL，然后在EP管中剪碎。样品尽量用新鲜的，不是新鲜的泡在PBS中一段时间也行。样品泡在TRIZOL里面后RNA就基本不会降解，这一步可以放在冰箱里面冻起来，可以保存一段时间2. RNA提取。往第一步中的剪碎的样品和TRIZOL中加入0.2ml的氯仿，之后剧烈摇晃。震荡，此时整个液体的颜色应该变成一种粉红色的。之后静置10分钟，静置后可以看到液体分层了。 12000转4度离心10分钟，可以看见液体分层很明显，最上面的是无色的水相，RNA就溶解在里面，中间一层是白色的固体，这层是蛋白质和DNA形成的复合体，下面是红色的酚相。把上层水相吸到另外一个管子里面，注意不要把下面的两层吸出来了，宁愿少一下没关系。 往水相液体中加入500ul的无水乙醇或者是异丙醇，上下颠倒混匀，此时如果RNA量多的话可以看见一些油一样的东西，反正就是感觉怪怪的那种，不过一般都不会出现明显的沉淀的。之后12000转离心10分钟，离心之后就可以看见管底有点半透明的东西了，那就是我们要RNA。倒掉无水乙醇或者异丙醇，加入500ul用DEPC处理水配制的70%乙醇，以洗涤RNA，加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来。之后在7500转离心8分钟，到掉乙醇，倒扣在干净的吸水纸上面，空气室温干燥，时间可以稍长点，40分钟到1小时，以看不见明显的液滴为准。干后用20ul或者30ulDEPC水溶解RNA，50度保温1小时。之后得到的RNA就可以泡个电泳或者测个浓度什么的，就看大家的需要了，具体方法可以自己查一查，因为我一般是用RNA做RT-PCR，或者是扩基因全长，所以我一般都不用电泳或者测浓度，都是等到逆转录完成之后，用beta-actin或者其他内参做个PCR检测RNA的质量。补充一点：上述实验和下面的逆转录都要在超净台里面完成。3. 逆转录总RNA提取之后，往往我们要的是mRNA,并且由于RNA不好保存，所以要把RNA经逆转录变成cDNA,就可以方便的保存和操作了。逆转录过程就是照着说明书一步步做了，所以就简单说一下。取8-10ulRNA，加上1ul的oligod(T),用水补足13ul,这一步RNA的量是可以调节的。70度变性10分钟，然后迅速放在冰上，这一步是为了让oligod(T)结合到mRNA上。当然，有的实验需要用随机引物做，大家自己把握。变性后加如5*buffer ,dntp,RNA酶抑制剂，逆转录酶，42度保温60分钟，这一步最好是在PCR仪上做。保温后再94度变性5分钟，冰上放置。好了，cDNA得到了，下面就是要检验一下质量了，也就是拿beta-actin引物为内参做个PCR了。看看扩出来的亮度怎么样了（具体的关于引物设计和PCR的优化有时间我会发到PCR版上去）。好了，如果内参扩出来比较好的话，那你就成功了，可以做下面的试验了。总的来说，RNA提取过程中最应该注意的就是RNA酶的防止，所有操作在超净台完成，然后一定要带一次性手套，而且一直要换。其他器具的处理就象前面说的那样了。p!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3aMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7NeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVn$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQi