四角蛤蜊多糖的提取工艺与单糖组分研究_金燕.pdf

第 28卷 第 3期 2 0 1 0年 3月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITI ONAL CHINESE M ED I CINE Vo l 28 No 3 M ar 2 0 1 0 中 华 中 医 药 479 学 刊 四角蛤蜊多糖的提取工艺与单糖组分研究 金燕 吴皓 常念 栾合密 王令充 南京中医药大学新药与海洋药物研究开发中心 江苏 南京 210029 摘 要 目的 从四角蛤蜊软体中提取多糖物质 并初步研究多糖提取物的组成和性质 方法 四角蛤蜊软体 经水提醇沉后得粗提物 粗提物过 732阳离子树脂柱后得四角蛤蜊多糖提取物 FT I R 分析多糖提取物的成分 蒽酮硫酸法测定多糖含量 TLC法鉴定粗提物和多糖提取物的单糖组成 结果 从四角蛤蜊软体中提取得到四角 蛤蜊多糖 总糖含量达 99 以上 蛋白含量小于 1 单糖组成主要由葡萄糖构成 结论 四角蛤蜊软体经水提醇 沉 732阳离子树脂柱后可得四角蛤蜊多糖 其单糖组成主要为葡萄糖 关键词 四角蛤蜊 多糖 提取 单糖组成 中图分类号 R284 1 文献标识码 A 文章编号 1673 7717 2010 03 0479 03 Isolati on of polysaccharide fromMactra Veneriform is JI N Yan WU Hao CHANG N ian LUAN He m i WANG L ing chong Nanjing University of ChineseM edicine Nanjing 210029 Jiangsu China Abstract O bjective To isolate the polysaccharide MVPS fromMactra Venerifor mis and characterize the products M ethods A routine methods of water extraction combined with alcohol precipitation was used to receive the crude macro molecules extracts fro mM actra Venerifor m is The crude extractswas refined by 732 cationic exchange resins and polysaccharide componentswere collected The polysaccharide products were analyzed by FT I R and itsmonosaccharide co mpositionwere identified by thin layer chro matography TLC The totalsugar contentwasdeter m ined by anthrone su l phuric acidmethod Results Total sugar content ofMVPS ismore than 99 and the protein content ofMVPS is less than 1 The TLC result shows glucose may be themonosaccharide co mposition ofMVPS Conclusion The polysaccharide ex tracts can be well got by the method used in this paper The monosaccharide co mposition ofMVPS is glucanmainly Keywords M actra Venerifor m is polysaccharide isolation monosaccharide component 收稿日期 2009 10 17 基金项目 国家海洋公益性行业科研专项基金项目 200705009 国家自然科学基金资助项目 30900293 作者简介 金燕 1982 女 江苏昆山人 硕士研究生 研究方向 中药海洋药物 通讯作者 吴皓 1957 女 江苏人 教授 博士研究生导师 四角蛤蜊是一种广泛分布于我国南北各海区的海洋经 济贝类 宋代5嘉祐本草6中记载蛤蜊肉 润五脏 止消渴 开胃 解酒毒 主老癖能为寒热者 及妇人血块 宜煮食 之0 多糖物质是海洋贝类的主要活性物质 具有抗肿瘤 抗病毒 抗心血管疾病 抗氧化 免疫调节等多种药用功 能 1 现代研究证明四角蛤蜊提取物多糖具有降血糖功 效 2 本文对四角蛤蜊活性成分多糖进行了提取分离研 究 1实验仪器与材料 1 1实验材料 四角蛤蜊软体 江苏省海洋水产研究所 提供批号 200711 732阳离子树脂 国药集团化学试剂有 限公司 批号 20080918 蒽酮 中国医药集团上海化学试 剂公司 批号 20010306 A 萘酚 国药集团化学试剂有 限公司 批号 T20050930 葡萄糖 国药集团化学试剂有 限公司 批号 F20080215 考马斯亮蓝 G 250 BIO MOL 分装 批号 0411S05 牛血清白蛋白 Am resco公司 批号 0628S04 其余试剂为国产分析纯 1 2实验仪器 TU 1800S紫外可见分光光度计 北京 普析通用仪器有限责任公司 FA1104型电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司 组织绞碎机 广东南海德 丰电热设备厂 725BASI C高速匀浆机 I KA公司 电热恒 温干燥箱 202型 上海索谱仪器有限公司 HH 4数显恒 温水浴锅 国华电器有限公司 薄膜旋转蒸发仪 BUCH I Rotavapor R114 80 2B型台式离心机 上海安亭科学仪 器厂制造 2实验方法 2 1四角蛤蜊粗多糖提取物的制备四角蛤蜊软体解冻 沥干 粉碎 加水煎煮 提取液过滤 滤液用减压薄膜旋转浓 缩 浓缩液离心后加 95 乙醇至醇浓度达到 80 冷藏静置 12h 抽滤 沉淀置真空干燥箱干燥后即得粗多糖提取物 2 2 四角蛤蜊粗多糖提取物提取条件优化 在四角蛤蜊 粗多糖提取物的提取过程中 水煎煮是影响多糖提取的主 要步骤 以提取液中糖含量为考察指标 考察水煎煮过程 479 第 28卷 第 3期 2 0 1 0年 3月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITI ONAL CHINESE M ED I CINE Vo l 28 No 3 M ar 2 0 1 0 中 华 中 医 药 480 学 刊 中软体粉碎程度 提取时间 煎煮时间和加水量 按照 L9 34 正交试验表设计实验 表 1 因素水平表 水平 因 素 绞碎程度 A 煎煮时间 B 每次煎煮加水量 C 煎煮次数 D 1整个30m in2倍1次 20 5cm绞碎60m in3倍2次 3匀浆90m in4倍3次 表 2不同提取条件对糖提取率的影响 序号 绞碎程度 A 时间 B 加水量 C 次数 D 总糖提取率 111112 64 212223 20 313333 87 421234 17 522313 19 623123 85 731323 99 832134 25 933213 54 K1 9 7010 8010 749 36 K2 11 2110 6410 9111 04 K3 11 7811 2611 0512 29 R2 080 620 312 94 2 3 四角蛤蜊粗多糖提取物中多糖的精制 3 称取 3g粗 多糖提取物 用 50mL蒸馏水溶解 过 732阳离子树脂柱 用蒸馏水洗脱 收集洗脱液 以 M olish试剂检测糖组份 洗出液未检出多糖时停止收集 用 0 5mol L 1NaOH溶 液调节洗脱液 pH至 7 0 减压薄膜旋转浓缩 乙醇沉淀 冷 藏静置 12h 滤过 干燥 即得精制后的四角蛤蜊多糖 用 硫酸蒽酮法测四角蛤蜊多糖中糖含量 4 用考马斯亮蓝法 测定四角蛤蜊多糖中蛋白含量 5 采用压片法 将样品与 溴化钾按 1B100比例混合 压片 测定红外吸收光谱 2 4 TLC法鉴定四角蛤蜊粗多糖和精多糖的单糖组成 精密称取四角蛤蜊粗提物和精多糖各 20mg 装入 10mL安 瓿中 加 1mol L 1的硫酸 5mL 封口 沸水浴水解 8h 以碳 酸钡中和硫酸 14000r m in 1离心 10min 上清液定容至 5mL容量瓶中 即得供试品溶液 对照品溶液用蒸馏水配 5mg kg 1的单糖对照品溶液于 5mL容量瓶中 将硅胶板 在 105e 下活化 1h 用玻璃点样毛细管分别将各单糖标准 品溶液 5mg mL 1 和四角蛤蜊粗多糖和精多糖全水解 液点样于硅胶板上 吹干 以 n BuOHB M e2COB H2O 4B 5B1 V V 为展开体系上行展开 显色时 将 DAP试剂 二苯 胺 苯胺 磷酸 喷洒与薄层板上 于 100e 烘烤约 10 m in 即显色 6 7 3实验结果 3 1 四角蛤蜊醇沉粗多糖提取物提取条件优化结果 根据结果 各因素对实验结果的影响为 A D有显著性差异 P A B C 故直观分析四角蛤蜊软体最佳提取工 艺为 A3B3C3D3 即取四角蛤蜊软体 解冻沥干后匀浆 煎煮 3 次 每次加软体重量 4倍量的水 每次 90min 表 3方差分析表 方差来源平方和自由度均方F显著性 A0 768920 384448 2 B0 068320 03414 3 C 误差 0 016020 00801 0 D1 446420 723290 7 注 F1 0 05 2 2 19 00 F1 0 01 2 2 99 00 P 0 05 P 0 01 3 2 四角蛤蜊粗多糖提取物中多糖精制结果 经过 732 阳离子树脂去蛋白后获得的四角蛤蜊精多糖为白色无定形 粉末 略有晶体光泽 用硫酸蒽酮法测得四角蛤蜊多糖中 总糖含量为 104 多糖含量为 93 用考马斯亮法测得 四角蛤蜊多糖中蛋白含量为 0 2 四角蛤蜊多糖红外吸 收光谱图见图 1 图 1 精多糖红外吸收光谱图 在 3400c m 1附近出现一个宽峰 是形成了氢键的 OH伸缩振动吸收峰 在 2938c m 1附近有一个中等吸收的 CH 伸缩振动峰 亚甲基所产生 可认为是糖类的特征 吸收 1485 1350cm 1之间出现的多峰为 CH 弯曲振动 吸收峰 O CH2所产生 1200 1020cm 1之间出现强峰 是环上缩酮或缩醛 C O 伸缩振动吸收峰 为糖类的特征 吸收之一 930cm 1附近吸收峰是 O CH2的 C O伸缩振 动吸收峰 也是糖类的特征峰之一 8 10 3 3 TLC法鉴定四角蛤蜊粗多糖和精多糖的单糖组成 见图 2 样品编号 1 D 阿拉伯糖 2 D 氨基半乳糖 3 D 半乳糖 4 D 葡萄糖 5 四角蛤蜊粗多糖水解液 6 四角蛤蜊精多糖水解 液 7 D 氨基葡萄糖 8 D 核糖 9 D 甘露糖 10 D 木糖 11 L 鼠李糖 图 2四角蛤蜊粗多糖和精多糖水解液及 标准单糖对照品的薄层层析图 480 收稿日期 2009 10 12 基金项目 国家自然科学基金资助项目 30701085 北京市属市管 高等学校人才强教计划资助项目 BAHED2006 作者简介 徐鹏 1985 男 湖北武汉人 硕士研究生 研究方向 中药材质量调控研究 通讯作者 刘长利 1976 男 河北承德人 讲师 博士 研究方 向 中药材规范化生产及其药材质量调控研究 T e l 010 83911633 E mai l lcl74 126 com 薄层层析结果显示 四角蛤蜊粗多糖和精多糖水解液 均呈单一棕色斑点 且其 Rf值与葡萄糖标准品一致 4讨 论 多糖具有调控细胞分裂和分化 免疫调节 抗肿瘤 抗 氧化 抗病毒等药理作用 多糖的结构 构象等与其生理功 能有密切关系 目前多糖提取方法主要有机溶剂提取法 酸提法 碱提法 酶解法 超滤法 超声法 微波法 超临界流 体萃取法 不同提取分离技术会造成多糖结构及活性的差 异 11 12 本实验优化水提法提取工艺并通过 732阳离子树脂柱 制得总糖含量达到 99 以上的四角蛤蜊多糖 该多糖为白 色无定形粉末 略有晶体光泽 四角蛤蜊精多糖红外光谱 特征显示其具有多糖的系列特征峰 薄层层析结果推测四 角蛤蜊多糖可能是由葡萄糖组成 其具体组成结构有待进 一步分析 参考文献 1 刘莺 刘新 牛筛龙 海洋生物活性多糖的研究进展 J 医药 导报 2006 25 10 1044 1046 2 吴皓 王令充 狄留庆 等 四角蛤蜊提取物及其制备方法和 应用 P 中国专利 200910027802 0 3 张莉 吴皓 阳离子交换树脂法除珠蚌蛋白质的工艺研究 J 南京中医药大学学报 2004 20 3 173 174 4 吴永霞 吴皓 狄留庆 等 两种淡水育珠蚌中多糖的含量测 定 J 南京中医药大学学报 2006 22 2 99 100 5 李建武 生物化学实验原理和方法 M 北京 北京大学出版 社 1994 160 176 401 406 6 张劲游 蔡顺养 糖类薄层层析的一个优良系统 J 中国抗 生素杂志 1986 1 3 226 227 7 焦广玲 于广利 赵峡 几种寡糖和单糖在不同展开体系中的 薄层色谱行为 J 中国生化药物杂志 2007 28 6 273 473 8 张正行 有机光谱分析 M 北京 人民卫生出版社 1995 39 103 9 夏朝红 戴奇 房韦 等 几种多糖的红外光谱研究 J 武汉 理工大学学报 2007 29 1 54 74 10 张剑韵 包立军 梁进 等 桑叶多糖的分离及红外光谱和气 相色谱分析 J 蚕业科学 2007 33 4 155 255 11 方崇波 海地瓜中多糖的提取和药理作用研究 J 时珍国 医国药 2003 14 2 76 77 12 张锦雀 黄丽英 苏聪枚 中草药多糖提取分离纯化研究进 展 J 中草药 2008 31 11 1760 1764 第 28卷 第 3期 2 0 1 0年 3月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITI ONAL CHINESE M ED I CINE Vo l 28 No 3 M ar 2 0 1 0 中 华 中 医 药 481 学 刊 高效液相色谱法测定甘草植物体内脱落酸含量的研究 徐鹏 刘长利 许利平 于萍 首都医科大学中医药学院 北京 100069 摘 要 目的 建立甘草植物抗旱信号传导物质脱落酸的含量测定方法 为揭示甘草抗旱性与有效成分积累 相关机制奠定理论依据 方法 甘草须根中的脱落酸用 80 的甲醇抽提 抽提液经过盐酸酸化 乙酸乙酯萃取最 终得到供试品溶液 应用 W aters C18色谱柱 4 6mm 250mm 5Lm 以乙腈 0 1 磷酸水为流动相 进行二元 梯度洗脱 流速 0 6mL m in