实验三PCR扩增制备目的基因.doc

反转录概念 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。区分:反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNADNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。2反转录酶与反转录过程 反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。 DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3末端以53方向合成DNA。反转录酶中不具有35外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。 RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5端水解掉RNA分子。 DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。 除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。反转录的简要过程表示如下： 反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3桹H末端上，按53方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。3生物学意义反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）。有些病毒（如阮病毒，即疯牛病病毒）以蛋白质直接形成蛋白质。（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。（3）在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。RNA反转为cDNA10l体系mix2lRNA500ngAdd to 10lPCR 程序37 10min855s稀释产物即可用于后续实验。实验三 PCR扩增制备目的基因1目的学会PCR操作的基本技术。2原理 是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性复性延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4试剂 3U/l Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。 5实验准备dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）合成的引物：Sense primer Antisense primer 目的基因模板质粒 待扩增的NK片段长度 6操作步骤（1） 在0.2ml PCR 微量离心管中配制20L反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算） dd water 13.9L 10PCR buffer（含MgCl2） 2L 2.5mmol/L dNTP 2L Primer1 0.5L primer2 0.5L 模板质粒 1L 3U/l Taq酶 0.1L（3u） 总体积 20L（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序： 94 3min 94 30sec 55 30sec 72 1min goto 35 times 72 10min（3）PCR结束后，取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是