口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法.doc

口腔内科论文口腔上皮细胞论文：口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法摘 要 目的分析人口腔黏膜上皮细胞培养的影响因素，并建立稳定的细胞培养体系。方法新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合处理口腔黏膜标本，比较不同浓度的Dispase对上皮的分离作用，酶消化法分离细胞，采用无血清培养液进行原代和传代培养。结果微生物污染得到有效控制，0.40%的Dispase的上皮分离效果优于0.25%的Dispase，细胞在短期内快速稳定增殖。结论人口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法经改进后可简化操作，并提高成功率。关键词 细胞培养；口腔黏膜；上皮细胞人口腔黏膜上皮细胞的体外培养对于研究口腔黏膜上皮细胞的生理、病理变化，上皮癌变过程以及组织工程化黏膜的构建具有重要意义。多年来，国内外许多学者一直致力于获得更为完善有效的口腔黏膜上皮细胞的培养体系。但是微生物的污染、人类黏膜组织来源的限制、上皮细胞不能贴壁以及所需营养成分复杂等仍然是上皮细胞培养成功的主要影响因素1。本研究对这些影响因素进行分析，试图通过培养体系的改进而探索更好的口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法。1材料和方法1.1组织来源2004年10月2005年6月于吉林大学口腔医院口腔颌面外科取唇裂修复术、智齿拔除术和鳞癌手术切除的口腔黏膜正常组织24例，患者年龄6个月76岁。其中，鳞癌患者的正常黏膜取自手术切除组织的边缘，并经病理切片证实无上皮异常增生，也未发生癌变。1.2主要试剂分离酶Dispase和角化细胞无血清培养液（keratinocyte-serum free medium，K-SFM）（Gibco公司，美国）；胰蛋白酶（上海生物工程有限公司）；胎牛血清（天津灏洋）；鼠抗人广谱单克隆角蛋白抗体AE1/AE3及SP免疫组化试剂盒（福州迈新）；其余试剂均为国产分析纯。1.3主要仪器和器材CO2饱和湿度细胞培养箱（Napco公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；超净工作台（苏州净化设备厂）；一次性细胞培养板和培养皿（NUNC公司，丹麦）；0.22m微孔滤器（Corning公司，美国）。1.4方法1.4.1标本处理 无菌条件下所取的口腔黏膜组织立即保存于D-Hanks液中，半小时内运送至细胞培养室。超净台内组织标本经PBS洗净血迹，0.06%的新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液浸泡2 min，再用含有硫酸庆大霉素的PBS（2g/L）依次浸泡10min、3min和2min。处理后的标本经眼科剪剪去部分黏膜下组织，并修剪成0.3 cm0.8 cm大小的组织块。1.4.2黏膜上皮的分离 所有黏膜组织被随机分为2组。一组黏膜标本放入0.25%的Dispase中，另一组黏膜标本放入0.40%的Dispase中，2组均置于4下消化22 h。取出后用眼科镊分别夹持标本的上皮层和上皮下层，将上皮分离下来，弃去上皮下层。经3位实验者完成操作，并一致确认每例标本上皮分离的结果，评判标准如下。有分离作用：标本的上皮被完整或部分分离下来；完整分离作用：每块标本的上皮均被完整分离下来；无分离作用：每块标本的上皮均不能分离下来。分别记录每组有上皮分离作用的例数，计算分离率。分别记录每组有完整分离作用的例数，计算完整分离率。比较2组分离率和完整分离率。1.4.3上皮细胞的培养 原代培养方法：上皮经PBS冲洗后加入到0.125%胰蛋白酶与0.01%EDTA（11）的混合消化液中37下消化510 min（2 min振荡1次），轻轻吹打，用含10%胎牛血清的D-Hanks液终止消化，用吸管吹打成细胞悬液，经200目无菌尼龙滤网过滤。PBS洗涤2遍，离心500 r/min10 min。细胞沉淀在K-SFM中重悬，血球计数板计数。细胞悬液以2.5105个/cm2的密度接种于培养板中，置375%CO2细胞培养箱中静置培养。第3天首次换液，培养液移入新孔中使未贴壁细胞继续贴壁。以后隔天换液1次。传代培养方法：当细胞达到80%90%汇合时，吸去培养液，0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA（11）的混和消化液消化细胞，至镜下观察细胞突起回缩，细胞变圆时终止消化，吸管反复吹打，离心800 r/min8 min，K-SFM重悬细胞沉淀，细胞悬液以12的比例接种于培养板或培养皿中继续培养，以后隔天换液1次。1.4.4细胞形态学观察 采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况并拍摄照片。1.4.5免疫细胞化学染色 取第2代细胞制细胞爬片，PBS洗涤3次后，4%的多聚甲醛溶液固定30 min，0.3%Trtion-100室温下处理10 min。用广谱单克隆角蛋白抗体及SP免疫组化试剂盒按试剂盒说明书进行免疫组化染色。以正常口腔黏膜组织石蜡切片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。1.5统计学分析将各组数据输入SAS 6.12统计软件，经Fisher确切概率法（Fishers exact test）检验，P0.05），0.40%浓度组有更高的趋势；2组完整分离率的差异有统计学意义（P0.05）。2.2标本处理效果和原代培养成功率各例上皮细胞原代培养过程中均未发生微生物污染。原代培养成功率为12.5%（3/24），其中13例有上皮分离作用的原代培养成功率为23.1%（3/13）。2.3原代形态学观察结果倒置相差显微镜下，胰酶消化后的上皮细胞大小不一，形态多样，其中小圆形细胞为具有增殖能力的健康细胞。接种后24 h，部分细胞贴附于孔底，随后细胞继续贴壁。刚贴壁的细胞折光性强，一般为圆形、椭圆形和三角形。随后细胞双极或多级伸出短小伪足，胞质逐渐展开。完全伸展的细胞呈扁平的椭圆形或多角形，胞核清晰，位于细胞中央，核仁12个。细胞一贴壁生长，就开始分裂增殖；23 d后，细胞数量明显增多，大小均一或散在个别不均一的大细胞。培养5 d左右时，细胞接近汇合，如铺路石状镶嵌（图1），高倍镜下可见部分细胞间波浪状或细丝状连接，似细胞间桥样结构。首次换液移出的细胞在换液后20 d左右达到80%的汇合，也呈铺路石状外观，但部分细胞胞浆内出现空泡，而且伸出细长伪足的细胞数量较多。2.4传代形态学观察结果细胞生长至80%90%汇合时传代。传代细胞贴壁比原代细胞快。1224 h传代细胞即可贴壁伸展。第23代是细胞生长的“黄金时期”，在增殖期间细胞呈椭圆形、短梭形或多角形，核分裂相多见，出现接触抑制现象，仍呈铺路石状排列，并散在个别较大的细胞（图2）。第45代，细胞形态逐渐变得不规则，有的细胞伸出长的伪足与邻近或远隔细胞相接。细胞胞浆内出现细小空泡和黑色颗粒，细胞增殖减慢，直至停滞。细胞逐渐衰老枯萎脱落。2.5免疫细胞化学检测结果实验组：角蛋白染色阳性，可见胞浆呈均匀的棕黄色，胞核呈淡蓝色（图3）。阳性对照组：上皮全层染色阳性，胞浆棕黄色；阴性对照：阴性。3讨论由于口腔黏膜处于有菌的环境中，所以微生物污染是上皮细胞培养的主要问题1-2，而且利用癌症患者的口腔黏膜标本进行原代培养时，组织带菌量更高3，可能是导致污染率增加的原因之一1。本研究的部分上皮组织来源于口腔癌患者，因此标本的消毒处理对于原代培养的成功显得尤为重要。以往的研究1指出甲醛溶液和乙醇等消毒剂在灭菌的同时也杀死了细胞，抗生素浓度的增加又导致细胞生长和形态的异常。新洁尔灭是阳离子表面活性广谱杀菌剂，一般对G+菌杀菌效果较强，而对G-菌杀灭效果较差。已有学者在牛眼小梁细胞和兔口腔黏膜细胞的原代培养中将新洁尔灭溶液用于标本的消毒处理，成功地进行了体外细胞培养4-5。考虑到口腔微生物群中G-菌和兼性厌氧菌占很大的比例，硫酸庆大霉素对G-菌杀灭效果较好，而且是抗需氧菌和兼性厌氧菌的有效药物，因此本研究采用硫酸庆大霉素溶液进行标本的进一步处理。本实验将新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合应用于人口腔黏膜标本的处理，原代培养过程中均未发生污染，并且缩短了处理时间，简化了操作，避免传统方法中多种抗生素长时间作用对细胞生长和形态的影响。因为上皮角化细胞生长需要局部分泌的生长因子，只有达到一定的细胞接种密度才能自我维持，所以组织大小对口腔黏膜上皮细胞培养的成功也是重要的1。Dispase是芽孢杆菌产生的一种中性蛋白酶，能选择性分解基膜的纤维连接蛋白和型胶原，可将上皮层从基膜处完整分离，保留上皮细胞的活力，作用快速、温和。与胰酶相比，Dispase完整分离上皮可获得单一的上皮细胞，避免成纤维细胞的污染，而且完整分离上皮可更好地保留基底细胞层，从而获取更多的增殖细胞。合适浓度的Dispase分离的上皮越完整则从有限的人口腔黏膜组织中获得的上皮细胞也越多。目前，国内外学者多采用0.25%或0.40%的Dispase进行上皮或表皮的分离，但有关Dispase浓度对上皮或表皮分离作用的影响报道极少。Fujita等6研究表明，裸鼠真皮表皮分离的效果取决于Dispase的浓度和皮肤所在的部位。伍津津等7对人真皮表皮分离方法的研究表明，在4下0.1%浓度的Dispase基本上没有分离作用，0.2%浓度有一定的分离效果，但不能完全分离表皮，而0.5%浓度分离效果非常理想，用镊子轻轻一揭便可将整个表皮完整地揭下来。本实验借助统计学研究方法，对常用浓度的Dispase分离口腔黏膜上皮的作用进行分析，认为4下0.40%的Dispase对人口腔黏膜上皮分离效果优于0.25%的Dispase，可获得更多完整的上皮。此外笔者以高密度接种细胞，使原代培养细胞快速增殖，在短期内达到传代要求。上皮细胞不能贴壁是上皮细胞原代培养失败的一个常见原因。胰酶对上皮细胞的损伤可能是细胞不贴壁的重要原因。胰酶分解细胞膜表面蛋白质，增加细胞通透性，加重离心对细胞损伤，而且细胞粘附相关的蛋白质也可能被消化，从而使细胞难以贴壁。因此，笔者采用低浓度的胰酶和EDTA的混合消化液进行单细胞悬液的获取，并且采用低强度，较长时间离心，从而降低细胞的损伤，并尽量避免细胞的丢失。另外，笔者将首次换液移出的细胞接种，使未贴壁细胞继续贴壁，在较长时间的增殖后，细胞达到了汇合，增加了可扩增的细胞数量。由于人口腔黏膜组织标本来源有限，外科手术丢弃的标本较小，结果必然导致可供增殖细胞的数量不足，这可能是本实验中多数上皮细胞原代培养失败的重要原因。此外，上皮细胞不能贴壁也是本实验中部分原代培养失败的主要原因，虽然本实验采取低浓度消化液和低转速离心等措施，但是可能还有一定程度的细胞损伤或者无血清培养条件的影响，有待于深入研究。Park等8最近提出磁力搅拌细胞分离方法在细胞获得率和克隆形成率方面优于传统的角化细胞分离方法，说明物理力在角化细胞原代培养细胞分离中是必要的。因此，本实验仅进行数次振荡的消化过程是不足的，需要改进。为了避免外源性异种蛋白和血清对上皮细胞的影响，现在国内外学者普遍采用无滋养层无血清培养方法9。本实验采用了角化细胞无血清培养液，该培养液作为一种选择性培养液可避免成纤维细胞的贴壁和生长，而且该培养液利于上皮细胞更快的增殖。鉴于抗生素长时间作用对细胞形态和生长的影响1，9，本实验未按照传统方法在培养液中添加抗生素或抗真菌药物，结果表明，只要切实遵守无菌操作规程,培养液中无需常规使用抗生素，从而避免抗生素对细胞生长和形态的影响。另外，在实验中观察到一个有趣的现象，即细胞培养至第45代时，有的细胞伸出长的伪足与邻近或远隔细胞相接，这与周海文等10的观察结果一致，对于这一现象的阐明有待于进一步的研究。参考文献1Reid 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