超滤技术在制药工业中除热原的应用.doc

超滤技术在制药工业中除热原的应用超滤技术在制药工业中除热原的应用楼福乐 毛伟钢 陆晓峰 梁国明 （中国科学院上海原子核研究所，上海 201800） 陆文达 黄梅菊 （上海福达药业有限公司，上海 201400）摘 要 介绍了热原的本质，它的定量表示及测定方法。随着膜分离技术的快速发展，采用超滤法去除注射液中的热原已在医药行业实际应用。列举了国外多项应用实例，并介绍了中国科学院上海原子核研究所生产的卷式超滤装置在药液除热原工艺中的使用情况。 关键词 热原 超滤 卷式超滤装置 分类号 TQ028.8 随着膜分离技术的迅速发展，在制药工业中应用超滤膜分离工艺除去（或降低）注射用药物（药液）中热原含量，使之符合药典规定，正在日益广泛的应用。例如日本、美国药典允许大输液除热原采用反渗透和超滤单元。而国内也正在探索和寻求用国产超滤设备去除热原的方法和工艺。中国科学院上海原子核研究所研制、生产出多种材质和规格的超滤膜以及板框式和卷式超滤系列设备，已在许多领域应用，为了在制药工业除热原项目的推广使用，笔者在有关文献的调研基础上进行了应用试验工作，并取得成功，从而促进超滤法除药液中热原这一工艺得到应用开发。 1 热原 11热原的本质 M.Thmas等1指出，热原（Pyrogen）又称内毒素（Endotoxin）,产生于革蓝氏阴性（Gram-nagative）细菌的细胞外璧，亦即细菌尸体的碎片。它是一种脂多糖物质（Lipopoly-saccharide），简称LPS，其相对分子质量从几千到几十万不等，根据产生它的细菌种类而定。在水溶液中，其相对分子质量可为几十万到几百万不等。最近已揭示了类脂A（Lipid）也是热原物质，构成为危害人体的内毒素，相对分子质量大约为2000。 永田彦等指出2，发热性物质即热原有两类：一类是低相对分子质量发热物质 _收稿日期：1998-10-12；修改稿收到日期：1998-11-23 第一作者：男，56岁，高级工程师 （Pyretice），另一类是高相对分子质量发热物质（Pyrogen），它们统称为内毒素。一般认为热原是指细菌发热物质，它由革蓝氏阴性细菌的细胞壁的外膜构成。更进一步分析其主要成份是脂多糖（LPS）及类脂A，是热原的活性部分。它们的相对分子质量一般为1万2.5万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达50万100万。这类物质具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。表1 LPS加热失活时间 加热温度 LPS失活时间/min250 30以上200 60以上180 120以上12热原的定量表示 热原可以用浓度来定量标度。文献大都以每毫升克数为浓度单位，一般单位为ng/ml，即10-9g/ml，或pg/ml，即10-12g/ml。也有采用EU/ml为热原单位。我国1998年药典确定用EU/ml为热原单位。两个单位之间的换算关系比较复杂，因为来自不同种类细菌的热原毒性表现不尽一致。美国有关部门对大量试样数据采用概率统计方法提出如下结果：对EC2类细菌1ng/ml5EU/ml；类细菌1ng/ml10EU/ml。日本药检部门报告对EKT类细菌1ng/ml8EU/ml。 13热原的测定方法 热原的分析、测定方法主要有鲎试剂法和家兔法。 131鲎试剂凝胶法 该法是利用鲎试剂检测供试品中或其表面可能存在的细菌内毒素浓度的一种方法3。目前，各国药典收载的细菌内毒素试验法均包含凝胶法。药品细菌内毒素检查是以凝胶法为基础，通过试验证明供试品某一浓度对凝胶法不存在干扰作用后，在供试品的有效浓度范围内，根据供试品的内毒素限值进行检测的一种方法4。 132家兔法 该法则为各国药典中规定的标准检测方法，可简述为取3只健康家兔各注入规定量的试样，在一天内单兔体温上升不超过0.6，3兔总升温不超过1.4，即被认为试验中热原含量合格。 14热原对人体的危害 据文献2报道，将热原浓度为5ng/ml的试样注入家兔体内，总量达到50ng/kg（体重）时，家兔体温上升值达0.6。人体感染发热的灵敏度是家兔的3倍。如有微量热原混入药剂中注入人体血液系统，会导致严重发热，甚至引起死亡。因此，尽可能降低药液中热原的含量是十分必要的，特别当注射液（如大输液）用量较大时，对热原的浓度要求应更为严格。例如上海长征制药厂对大输液的热原合格指标控制值为0.25EU/ml。 2 超滤膜分离法去除药液中热原 注射用药液（或注射用水）除热原，使之符合药典的检测规定，是医药工业中的基本生产环节。目前，一般介绍除热原的方法有以下3类： 蒸馏法生产去热原水，作注射用水、洗涤水等，但其成本较高。 吸附法除热原。其中方式一是表面吸附剂吸附致热性物质，而让产品物质通过。方式二是吸附剂吸附产品物质，让热原流出，再把产品物质从吸附剂表面解析回收。用作吸附的物质可以是硅泥、活性炭和离子交换树脂等。禁止使用石棉作为吸附剂。 膜分离法除热原作为一种新工艺、新技术，正在制药行业推广应用。 21超滤法除热原 超滤法除热原是一种物理分离方法，选用何种规格的超滤膜为宜，首先须了解药液中e热原的相对分子质量大小、性质以及浓度。 文献1提出，由于脂多糖的终端结构类脂A具有较小的相对分子质量，因此需选用切割相对分子质量小于5000相对分子质量的超滤膜。如果选用截留相对分子质量为1万至20万的超滤膜，除去相对分子质量为几万到几百万的热原，则应再使用热原吸附剂除去小相对分子质量的热原，包括相对分子质量约为2000的类脂A。这些不同规格滤膜的平均孔径为2nm到0.1m 稻见良秋等报道5，用超滤法除热原，必须采用孔径为1nm的超滤膜，截留相对分子质量6000左右。但产量低，处理量大时，设备大型，压力要求也较高。其次，采用截留相对分子质量规格为5000或10000的超滤膜除热原，对部分含有较大相对分子质量成份的药液是不合适的。因为，在除去热原的同时会把药液中的有效成分阻留与吸附，使产品得率大受影响。因此，也有选用10万至30万截留相对分子质量的滤膜除去大部分发热性物质后（产品物质基本上通过滤膜），再采用热原吸附剂除去余下部分热原，使得产品收得率既高，去除热原效果又好。为了提高产量，采用聚酰胺（尼龙）为原料制成的微孔滤膜，过滤热原浓度为20ng/ml的自来水，由于材质具有特异的吸附热原的特性，过滤后的水质符合药典规定，其产量高达2000L/（m2h）。 K.Mueeller报道6，除热原用超滤膜的截留相对分子质量规格是6000。 永田彦在其专利2中称，一般的注射液，为除去低相对分子质量发热物质，采用截留相对分子质量1万的超滤膜。 田原修等7采用截留相对分子质量为1万的超滤膜，平板式装置，除去乳酸钠中的热原。 桥本雅文8指出，一般从低相对分子质量药液中去除热原采用截留相对分子质量为1万的滤膜，包括静脉注射液除热原。 MMSolin报道9，用尼龙66制成的带电荷微孔滤膜，孔径大小为0.1、0.2m和0.45m，也可用于对相对分子质量为4万的葡聚糖溶液除热原。其中0.45m的微孔膜作预处理，0.1m和0.2m的微孔膜进一步作除热原处理。 综上所述，超滤膜孔径及材质的选择，需视被处理药物的相对分子质量、特性，及药品中热原的含量而定，通过工艺试验选择最为合适的超滤膜规格及处理工艺。 22超滤法除热原的效率 由于超滤膜的活性层很薄，用久了可能会出现针孔，降低截留率造成热原和细菌的泄漏，另外设备结构上的不合理也可能存在卫生死角而影响滤清液的质量，若再加上存在类脂A的致热物质，因此超滤除热原的效果往往达不到百分之百的清除，表2就文献报道中的有关数据予以归纳。 表2 超滤除热原效率 项目 热原浓度/（ngml-1）原液 滤清液 去除率/% 滤膜规格膜孔径/m 截留相对分子质量/万SOD药液除热原 约1万 110 99.999.99 10HAS的精制 1300 3 99.8 8乳酸钠除热原 _ _ 97 1制备超纯水 7.1 0.1 98.6 0.01 自来水除热原 20 合格 90 0.2 药液 500 97 0.1 由表2可见，超滤膜对热原的去除率较高，变化范围较宽，高达99.99%，低为90%以上。究其原因可知，热原是一类形态和相对分子质量均不确定的物质，热原的种类、浓度随药液而异，因此热原去除率也是个多因素决定的量。 3 超滤除热原国内外应用实例101331 SOD药液除热原2用二级处理工艺，超滤 + 吸附法，使SOD药液的回收率、产量、重复性、可靠性和经济性方面都十分优异。 滤膜截留相对分子质量为10万，对牛血清蛋白（相对分子质量6.7万）的截留率为6080%，二级脱热原吸附剂经筛选后确定，对药液的化学组分适当调整，有利于提高收率。超滤膜的再生采用通常的1mol/L的NaOH浸泡处理，吸附剂的再生经三步处理。SOD药液经家兔法检测，呈阴性。处理结果列于表3。 表3 超滤、吸附法除SOD药液中热原 发热性物质去除方法 热原浓度/（ngml）-1 处理前 处理后 SOD回收率/%膜过滤+去热原吸附剂处理 约1万 0.01以下 96膜过滤 约1万 110 98吸附法（比较例） 约1万 10100 32治疗脑血栓新药（Prourikinase）除热原7 本药品为治疗脑血栓的特效药，注射治疗，药品中的蛋白质相对分子质量约5万。为此而研制了截留相对分子质量规格为30万的超滤膜，用作一级超滤处理。二级处理亦用脱除热原吸附剂。处理后的主要结果见表4。 表4 超滤、吸附法除Prourikinase药液中热原 发热性物质去除方法 内毒素浓度/（ngml）-1 处理前 处理后 药液成分收得率/%膜过滤+去热原吸附剂处理 0.1万 0.01 90膜过滤 0.1万 110 98脱热原吸附柱（比较例） 0.1万 10100 33乳酸钠除热原6 由于质量分数为70%的乳酸钠粘度高，采用截留相对分子质量1万的滤膜过滤时通量较低。为了提高产量，采取对设备、管路夹套加热的方法，使料液升温至5060，这个措施明显地提高了处理产率，如图1可见，58时的过滤速度为40时的2.5倍，而热原去除率保持在97%以上。温度超过60后，由于膜孔径放大，膜的截留率下降，致使除热原效果明显下降。所以说，超滤法除热台对不同的药液均有一个确定工艺条件的试验过程。 图1 超滤产量与料液温度关系 34制备超纯水14采用超滤组件 + 离子交换 + 离子交换纤维三级处理流程，构成小型化超纯水制备装置，满足电子、医药、精密化学分析等部门的使用要求。其中离子交换纤维是专利成果。超滤膜的分离孔径为10nm，内径250m，膜厚30m，过滤面积1.6m2，装填混合树脂MB-2型1.8L，纤维混合体0.2L，流速50L/h，装置体积45cm45cm25cm，质量20kg，一次可制纯水600L，水质指标详见表5。 表5 超纯水制备水质一览表 项目 比电阻/(Mcm) 钠/(ngg-1) 二氧化硅/(ngg-1) 细菌/(个ml-1) 热原/(ngml-1) 0.2m微粒/(个ml-1) 有机物/(ngg-1)原水 0.01 600 980 0.6 7.1 1105 900超纯水 18 1 5 0.1 0.1 15 703.5“超滤吸附法”工艺 MThomas1经过大量试验，建立了“超滤吸附法”除热原新工艺。该工艺中使用的超滤膜的截留相对分子质量为1万20万，膜的平均孔径为0.0020.1m，通常为320nm，这种膜具有较大的空隙和较高的通量，可去除相对分子质量数万至几百万的热原，然后用除热原吸附剂除去相对分子质量几万以下的热原以及相对分子质量大约为2000的类脂A物质。该工艺在超滤膜使用较长时间截留率降低后，热原也可以被吸附剂除去，并且相对分子质量为2000的类脂A也能有效去除。该工艺可以使医药的有效成分很容易地透过膜，从而提高药品的收得率。 该工艺使用的超滤膜材质有聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等，设备形式可以为中空纤维、卷式、折叠式或板框式等。这些不同形式的设备各具有特点，其中由卷式超滤组件构成的设备膜面积大，滤膜更换方便，但对原液的预处理要求较高。中空纤维超滤组件的滤膜装填密度高，泵容量小，但不能单独换膜，对原液预处理要求高。板框式超滤设备原液预处理容易，滤膜可单张更换，单设备体积较大，预清洗有一定难度。 该工艺采用多种材质与型号的吸附剂。对原液中的热原浓度要求低于104ng/ml为宜。 该工艺的应用实例包括制备酶制剂，合成蛋白质、肽、荷尔蒙和多糖物质的药类，大输液如葡聚糖输液、果糖输液、葡萄糖输液等。柠檬酸钠注射液的生产也可采用本项工艺。 应用实例，人体血清蛋白（HSA）的精制，先用截留相对分子质量为10万的中空纤维超滤膜组件过滤，再流经装有吸附剂的吸附柱。HAS的质量分数从5%降至3.2%或3%，热原则从1300ng/ml分别降至3ng/ml和0.016ng/ml。产品的回收率为60%，超滤热原的去除率为99.8%，全工艺为99.998%。 4 上海原子核研究所超滤除热原应用实例 41硫酸（双庆）链霉素药除热原试验 上海第四制药股份有限公司采用卷式超滤器小装置，配以2万截留相对分子质量的膜柱，进行了硫酸（双庆）链霉素药除热原试验，除热原效果如表6所示。 表6 家兔法测试热原结果 试验序号 家 兔 测 试 升 温 /处 理 前 处 理 后 药剂回收率/%1 1.00 1.05 0.70 0.35 0.30 0.25 94.02 0.60 1.75 0.95 0.40 0.25 0.15 92.33 0.80 0.60 1.30 0.40 0.25 0.20 97.14 1.20 1.30 0.80 0.25 0.25 0.20 94.9试验结果表明，采用超滤法代替传统的活性炭吸附热原，对硫酸（双庆）链霉素生产是可行的。 42中药制剂黄芪注射液的除热原超滤 上海福达制药有限公司HPL型板框式超滤器，配备1万截留相对分子质量的PES膜，进行中药制剂黄芪注射液的除热原超滤，再经适量活性炭吸附，使成品热原合格率（无论经鲎试剂凝胶法还是家兔法检测）从原来经常波动到目前100%合格。由于中药液有效成分，如黄酮类、生物碱类、总甙类等成分，其相对分子质量都在1000以下。因此，中药制剂尤其是注射剂使用超滤除热原除菌是最合适的，可以使产品达到静脉注射剂的质量标准。 43氨基酸产品的除热原试验 与上海天厨味精厂合作进行了超滤法氨基酸产品的除热原试验。试验按实际生产的八分之一（500L）进行，采用HW型卷式超滤器和截留相对分子质量1万的SPES型超滤膜，在运行压力、流量、温度和浓缩倍数对产量的影响试验工作基础上，以最佳运行参数进行除热原试验，取得了良好效果，结果见表7。在中试取得成功的基础上，该厂装配了上海原子核所生产HW4-2型卷式超滤器（有效膜面积48m2），已投入生产，运行一年多来，情况很好。 表7 氨基酸除热原试验结果 试验日期 样品名称 样品稀释倍数 鲎试剂法测试结果 家兔法测试结果05-28 丙氨酸原液丙氨酸超滤透过液 5 阳性阴性 合格05-29 谷氨酸原液谷氨酸超滤透过液 5 阳性阴性 合格06-21 谷氨酸原液谷氨酸超滤透过液 5 阳性阴性 不合格合格06-22 赖氨酸原液谷氨酸超滤透过液 5 阳性阴性 合格07-16 丙氨酸原液丙氨酸超滤透过液（第1min）丙氨酸超滤透过液（第40min）丙氨酸超滤透过液（第67min）丙氨酸超滤透过液（第110min） 5 阳性阴性阴性阴性阴性 膜分离技术，尤其是超滤技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途的一项重大生产技术，目前不仅只是研究、研制，同时已在各个领域尤其是制药工业中正在兴起应用的高潮。原子核所生产的和正在研制的各种规格的超滤、钠滤膜，HW型卷式和HP型板框式超滤器，将尽可能地满足各个领域的需求，使我国的膜分离技术赶上和达到国际水平。 参考文献 1 Thmas M,Escoubanne M.Preparation of pyrogen-free solution for medical 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