FISH技术与其在环境微生物中的应用.docx

哈尔滨师范大学学年论文题 目 FISH技术及其在环境微生物中的应用学 生 李晓晶指导教师 王继华 教授年 级 2009级专 业 生物科学系 别 生物学系学 院 生命科学与技术学院哈尔滨师范大学2012年4月论 文 提 要 荧光原位杂交与微量自动照相集成技术(FISH)能够同时在单细胞水平原位进行细胞的分类鉴定与细胞对底物的吸收特性研究,这是微生物学研究领域的一大突破。目前,这一技术已有效应用于工程系统(污水处理厂、生物反应器等)与自然生态系统中微生物的研究。污染水体的原位强化净化及其生态修复与微生物也有着密切的关系,因此,这一技术的应用不仅能够提高工程系统污水处理效率, 也将为受损水生态系统的原位修复提供科学依据。FISH技术及其在微生物学中的应用李晓晶摘要：微生物对整个生态系统具有重要的影响,了解与检测微生物的种类具有十分重要的意义。但是传统的培养方法又不能满足科学研究的需要,荧光原位杂交技术(FISH)就是今年发展起来的一种快速准确检测微生物的方法。较全面地介绍了FISH技术的优点、微生物的分离与固定方法，以及原位杂交过程，同时对FISH技术在环境微生物学中的应用作了详细研究。关键词：荧光原位杂交 检测环境微生物学 种属特性 功能特性污水处理、受损水生态系统的原位修复均与微生物有着密切的关系。因此,对于相关微生物的研究是这一领域的重要研究内容之一。当前,在自然界的微生物群落中绝大部分种类尚不能进行培养(如海水中可培养的微生物只占到总数的0.001%0.1%；淡水水体或底泥中相对较多,但也只占到总数的0.25%1)。为了在尽量不破坏周围环境的基础上研究这些尚无法培养的微生物,在过去的十多年里,微生物学家引入了分子生物学技术,如荧光原位杂交(FISH)、多聚酶链(PCR)、DNA测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等2。这些技术在微生物生态学中的应用揭示了环境中微生物群落结构与多样性的大量信息。然而,这些方法一般不能检测微生物在其生存的微生态环中的功能特性。而在研究微生物时,不管是研究微生物的富集培养与分离,还是研究微生物技术的应用都需要在了解微生物分类鉴定的同时,了解微生物的各种功能特性。有研究者已经开发了一些可以同时研究微生物分类鉴定与功能特性的方法,如FISH/CTC还原结合、MAR(微量自动照相术)与免疫荧光联用技术、FISH-微电极技术等,但这些技术在研究复杂环境微生物群落中的个体微生物时存在很多局限3-4。上世纪末,研究者开发研究了一种新技术,即荧光原位杂交(FISH)与微量自动射线照相(MAR)集成技术(本文中FISH/MAR技术),也有称其为MAR- FISH、STARFISH、Micro FISH 等5-6。应用FISH/MAR 能同时在原位水平从复杂微生物种群中获得特定微生物的种属与功能特性,从而更好地了解特定微生物在环境中的作用,更清楚地解释自然或人工生态系统中微生物多样性与微生物群落结构多样性的原因及其与微环境的相关关系。1 FISH 技术简介1.1原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是: 如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲与素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 1.2实验流程 FISH样本的制备探针的制备探针标记杂交染色体显带荧光显微镜检测结果分析。 1.3特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记与非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。 FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂与探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 1.4应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。2 FISH技术在环境微生物研究中的应用2.1 工程系统中微生物功能特性及生理特性研究这里所说的工程系统是指污水处理厂、生物反应器等人工构建的生态系统。FISH在这一领域的应用涉及到活性污泥中污泥膨胀微生物,活性污泥、生物膜与生物絮体中氨氧化菌、硝化菌、反硝化菌、硫细菌、铁()还原菌等微生物生理与功能特性的研究。其中应用比较多的是污泥膨胀微生物。2.1.1污泥膨胀微生物污泥膨胀是污水处理厂运行管理的常见问题与难题。引起污泥膨胀的丝状菌具有丰富的多样性,不同类型丝状菌,来自不同污水厂的同一类型丝状菌都反映出不同的底物吸收特性。研究丝状菌的种群及功能特性,并将有关研究推广,可以帮助阐明导致活性污泥膨胀的环境因素,从而最终便于污泥膨胀类型的快速诊断以及针对病原微生物的生理特性实施合理的补救措施7-8。Nielsen等研究了不同环境条件下的活性污泥中的Thiothrix nivea 与Thiothrix 属其它成员对14C标记的醋酸盐与14C标记的重碳酸盐的吸收特性9。研究明,Thiothrix 细胞除具有异养与混合营养特性外,还具有化能无机自养生长特性。2.1.2氮循环细菌氮是引起水体富营养化的重要环境因子,细菌在氮的生物地球化学循环过程中起着极其重要的作用,于是氮循环细菌也就成为很多学者的研究对象。Daims 等利FISH/MAR技术研究了Nitrospira 类细菌(来自不同污水处理厂的硝化生物膜与活性污泥)在不同培养条件下对碳源的吸收情况10。Lee 等用14C标记的重碳酸盐与NEU探针(亚纲氨氧化菌的好盐与耐盐氨氧化菌特异性)研究了硝化过程中的微生物。结果表明, NEU 与MAR 阳性细胞与氮去除率之间存在正相关关系。Ginige 等联合使用稳定同位素探测技术( stable- isotope probing(SIP) )以及FISH/MAR 技术,研究了以甲醇为碳源的反硝化SBR反应器中的反硝化微生物,首次报道了起反硝化作用的Methylophilales 科的微生物( -Proteobacteria 与Methylophilales 目)11。 2.1.3磷循环细菌污水生物除磷中的主角聚磷微生物的研究对于进一步改良生物除磷工艺,深入理解环境中磷的生物地球化学循环,都有着非常重要的作用。Lee 等研究了利FISH/MAR 技术确定聚磷微生物的可行性,采用33Pi 研究了属于与-Proteobacteria亚纲的具聚磷功能的细菌,研究表明聚磷菌主要隶属于-Proterobacteria 亚纲, -Proterobacteria 比Acinetobacter spp. 与- Proteobacteria 亚纲的其它细菌在增强型生物除磷( EPBR)工艺中起着更为重要的作用12。Lee 等对两个增强性生物除磷( EBPR)活性污泥中试系统进行2.5a 的监测,其中一个同时有脱氮功能,另一个没有脱氮功能。他们的研究表明,两个系统中对磷起到去除作用的是混合细菌群落,包括一部分Rhodocyclus 类细菌、Actinobacteria 与其它没有鉴定的细菌13。Kong 等利用染色方法与FISH/MAR技术,研究了某SBR 生物膜中的微生物14。研究表明,细菌群落中的- Proteobacteria 亚纲与Rhodocyclus 类微生物直接与磷的去除效率有关,大部分Rhodocyclus类微生物在厌氧条件下能同化醋酸与poly- -hydroxyalkanoates(PHA),在好氧条件下能同化33Pi,另外一些Actinobacteria 也能同化33Pi。 2.1.4其它细菌Ito 等研究了污水管道生物膜中硫酸还原菌(SRB)对底物的吸收特性及其系统发育亲缘关系15。他们的研究结果表明,所研究的污水管道生物膜中SRB的优势子群是Desulfobulbus, 其数量占到SRB总数的23%。检测到的Desulfobulbus 的约9%27%能够以氧气与硝酸氮作为电子受体吸收14C标记的丙酸盐,这也就解释了为什么在许多好氧环境中这些微生物的丰度很大。Nielsen 等利用MAR技术进行了Fe( )还原条件下活性污泥中消耗醋酸盐细菌的计数16。研究结果表明,异化铁还原菌占到细菌总数(DAPI染色)的3%。与传统的最有可能数目法(MPN) 与改进MPN 法相比,MAR 是一种更加可靠的方法,同时通过FISH得出了所研究的铁还原菌的种属特性。 2.1.5活性污泥数学模型活性污泥数学模型的研究能够指导活性污泥工艺设计,研究活性污泥工艺的动态过程, 并便于实现系统的高效率低能耗运行。在现存的活性污泥模型中包括很多描述微生物同源性、活性与动力学特性的参数与常数。这些参数与常数中的一部分,如不同污水处理厂促使一些过程( 硝化、反硝化、生物除磷)发生的细菌的数量可以通过FISH/MAR 技术得到17。这些信息可以与传统方法测得的微生物一般活性( 如硝化速率、磷吸收或释放速率等)进行比较, 并且能够得到单位细胞的比活性,以用于改进模型。利用FISH/MAR技术还有可能研究特定功能微生物群落( 如磷细菌)的原位功能特性,从而得到有效利用有机物( 醋酸或其它) , 利用硝酸盐的能力等信息。另外,还能回答同种微生物在不同污水处理厂的功能18等问题。由于在建模过程中必定要进行一定的简化,这些问题对于数学模型的改进都是相当重要的。2.2 自然系统中微生物生态生理学研究除了污水处理厂、生物反应器等工程系统以外,FISH/MAR 技术也已应用到自然生态系统中,研究自然生态系统中微生物与不同物质的生物地球化学循环的关系,如淡水生态系统底泥微生物与海水浮游细菌等的研究。2.2.1淡水系统Achromatium oxaliferum 是一种大型的、形态特异的硫氧化菌,主要分布在淡水与黑色底泥环境中。Gray 等利用FISH/MAR 技术对淡水底泥硫氧化菌的研究结果表明,来自淡水底泥的Achromatium细胞能够从重碳酸盐、醋酸盐与蛋白质水解产物中吸收14C,能够将亚硫酸盐氧化成细胞内的元素硫19。这些发现给Achromatium 在底泥复杂硫循环中作用的深入研究奠定了扎实的理论基础。2.2.2海洋系统Duverney 与Fuhrman研究了加利福尼亚海岸海水样品中-Proteobacteria 与Cytophaga-Flavobacterium 对3H 标记底物的原位种属与功能性。研究结果表明,这些微生物不仅在样品中的浮游微生物群落中占到很大的比重,它们对于溶解性氨基酸的吸收起到主要的作用。Cottrell 与Kirchman应用FISH/MAR 技术研究了不同原核生物利用海洋溶解性有机物(DOM)的相对贡献率20。在北美海岸与河口水体的研究中,他们发现该环境中存在的大量优势细菌群组,即、- Proteobacteria 与Cytophaga - Flavobacterium,对DOM的吸收特性存在着明显的区别。Otte等在远离智利与秘鲁海岸的大陆架发现了高密度的Thioploca 属的丝状硫细菌,并利用FISH/MAR 技术研究了这些细菌对碳的新陈代谢能力。Vila 等使用FISH/MAR 技术研究了墨西哥湾与地中海西北海岸的硫循环微生物,结果表明Roseobacter 进化枝(- proteobacteria) 占到能结合35Sdimethylsulfoniopropionate(-二甲基巯基丙酸内特盐, DMSP)的微生物的13%43%。- proteobacteria 与Cytophaga- Flavobacterium 也能从DMSP 中吸收硫。Roseobacter 与a- proteobacteri 在所有能从DMSP吸收硫的DAPI阳性细胞中占到最大的比例( 50%)。他们的研究表明,从DMSP 中利用硫是海洋活性细菌的一个普遍特性。这些研究指出,DMSP是许多海洋浮游细菌的一种重要底物。2.2.3河口系统Cottrell 与Kirchman利用FISH/MAR 技术研究了不同水生态系统中不同细菌群落对细菌产量的贡献。河口不同盐度条件下的主要细菌群落都能同化3H标记的胸苷与亮氨酸,包括- 、- 与- proteobacteria 以及Cytophaga 类细菌。但是,不同群落同化这些化合物的贡献率有很大的区别。参考文献1 朱文优,张忠刚. 分子生物学技术在环境微生物研究中的应用J宜宾学院学报 2009, (06) .2 蒋建林,周权能等 PCR-RFLP技术分析沼气池厌氧活性污泥细菌的多样性J广西农业生物科学 2008, (04) . 3 成喜雨,庄国强,苏志国,刘春朝. 沼气发酵过程研究进展J过程工程学报 2008, (03) . 4 刘然,彭剑峰,宋永会,王毅力,于雷,袁鹏,解明曙. 厌氧折流板反应器酸化及其对微生物种群分布的影响J环境科学 2010, (07) . 5 谢晴宜,洪葵. 微生物资源的生物勘探J热带作物学报 2010, (08) .6 方曦,杨文. 海洋石油污染研究现状及防治J环境科学与管理 2007, (09) . 7 陈建秋. 中国近海石油污染现状、影响与防治J节能与环保 2002, (03) . 8 徐艳辉,李烨,许向阳. 番茄枯萎病的研究进展J东北农业大学学报 2008, (11) . 9 邓强,张焜,蔡燕飞,何成新,赵肃清. 甘蔗渣纤维素的微生物与酶降解研究进展J化学工程与装备2008，（05）. 10 李燕红,林钰,杏艳,樊耀亭,张亚辉. 农作物秸秆废弃物厌氧发酵生物制氢的研究J环境科学与技术 2006, (11) . 11 顾钢,马驰. 2004年世界能源发展总态势J