高效液相色谱法同时测定食品中苯甲酸山梨酸脱氢乙酸的步骤.doc

高效液相色谱法同时测定食品中苯甲酸山梨酸脱氢乙酸的步骤1 材料与方法：1.1仪器：(1)高效液相色谱仪 (2)分析天平， (3)酸度计， (4)离心机， (5)振荡器， (6)超纯水仪； 试剂：(1)苯甲酸， (2)山梨酸， (3)脱氢乙酸， (4)甲醇； 提取试剂：(1)0.3%盐酸乙醇溶液, (2)0.02mol/L磷酸氢二钾溶液1.2标准溶液的配制精密称取苯甲酸，山梨酸，脱氢乙酸对照品各适量，加乙醇溶解，配制成1.0mg/ml 的标准储备溶液。1.3色谱参数和条件（1）色谱柱：DIONEX Acclaim 120 C18(4.6*250mm,5m)（2）流动相：甲醇0.02mol/L磷酸氢二钾溶液（10:90）（3）流速：1.0ml/min（4）进样量：10L（5）检测波长：230nm(苯甲酸，山梨酸)，293nm（脱氢乙酸）1.4样品处理1.4.1 固体样品（如熟肉制品.豆制品及糕点类） （1）称取捣碎混匀的样品5g ( 精确至0.01g ) 于具塞三角瓶中，（2） 精密加入25ml提取溶剂，振荡1h后，于4放置24h ，（3） 离心，取上清液3ml，用水定量稀释至10ml，离心，经0.45 m滤膜过滤，（4）进液相色谱仪分析。1.4.2 液体样品( 如冷冻饮品) （1） 将样品于室温下解冻后，称取10g ( 精确至0.001g ) 于25ml 量瓶中，（2） 用提取溶剂定容至刻度，混匀，于4放置24h ，（3） 离心，取上清液3ml ，用水定量稀释至10ml，离心，经 0.45m滤膜过滤，（4） 进液相色谱仪分析。2数据处理2.1标准曲线与检出限精密量取标准储备溶液适量，用提取溶剂定量稀释制成每ml中含0.1g,0.5g,1g,4g,8g,12g,16g,20g的标准混合溶液，按前述色谱条件进行测定，且每个浓度做两组平行试验，以浓度C(g/ml)为横坐标，峰面积A为纵坐标制作标准曲线；标准混合溶液的浓度（g/ml）0.10.5148121620峰面积以浓度C(g/ml) 对峰面积A进行线性回归，按信噪比3，计算检出限2.2 精密度和方法回收率试验 （1）精密度实验：取同一对照品溶液( 各浓度均为10g/ml ) ，重复进样，测出各峰面积的 RSD值。相对标准偏差(relative standard deviation RSD)，又称为变异系数（Coefficient of variation,C.V.），通常用百分数表示用来评价定量分析结果精密度的量度，是对同一样品多次测定结果的重复性和再现性的评价。本实验采取8次样品的结果测定而计算最后测得数据的RSD。RSD计算如下公式： 其中：标准偏差(Std Dev,Standard Deviation)n次测定值的算术平均值精密度的测定通过测定多组数据而测定标准偏差来评价，本方法通过测定10g/ml的对照品溶液测定9组，且每组做2个平行；样品名峰面积 (S*min)浓度 (mg/L)精密度10g/ml-1精密度10g/ml-1精密度10g/ml-2精密度10g/ml-2精密度10g/ml-3精密度10g/ml-3精密度10g/ml-4精密度10g/ml-4精密度10g/ml-5精密度10g/ml-5精密度10g/ml-6精密度10g/ml-6精密度10g/ml-7精密度10g/ml-7精密度10g/ml-8精密度10g/ml-8精密度10g/ml-9精密度10g/ml-9将每两组平行实验结果取平均值且通过计算出来的平均值通过excel计算出其标准偏差s样品名各组平行实验浓度平均值(mg/L)平均值标准偏差精密度10g/ml-1精密度10g/ml-2精密度10g/ml-3精密度10g/ml-4精密度10g/ml-5精密度10g/ml-6精密度10g/ml-7精密度10g/ml-8精密度10g/ml-9=（2）回收率实验： 准确度的计算通过测定加标回收率,配制一定浓度水平的混合标准溶液，按8mg/kg,10mg/kg,12mg/kg的量加入样品中,且每个浓度做3组，每组均做2个平行试验，使数据更为精准。按1.4方法处理，做回收率试验样品名峰面积 (S*min)浓度 (mg/L)回收率8mg/kg-1回收率8mg/kg-1回收率8mg/kg-2回收率8mg/kg-2回收率8mg/kg-3回收率8mg/kg-3回收率10mg/kg-1回收率10mg/kg-1回收率10mg/kg-2回收率10mg/kg-2回收率10mg/kg-3回收率10mg/kg-3回收率12mg/kg-1回收率12mg/kg-1回收率12mg/kg-2回收率12mg/kg-2回收率12mg/kg-3回收率12mg/kg-3未加标0.0000.0000准确度的评价通过测定回收率的方法，将被测样品分为两份，其中一份加入已知量的欲测组分，然后用同样的方法分析这两份样品，按公式计算回收率：测出加标的回收率越接近100%，说明此定量分析结果的准确度就越高。样品名平行实验浓度平均值(mg/L)回收率各加标量回收率平均值回收率8mg/kg1回收率8mg/kg2回收率8mg/kg3回收率10mg/kg1回收率10mg/kg2回收率10mg/kg3回收率12mg/kg1回收率12mg/kg2回收率12mg/kg33. 结果与讨论3.1流动相及检测波长的选择国家标准中测定防腐剂时流动相采用甲醇乙酸铵溶液系统，而乙酸铵溶液缓冲能力较弱，部分样品溶液对PH较为敏感，从而导致脱氢乙酸峰出现拖尾，甚至与山梨酸峰无法完全分离有机酸的HPLC分析中，甲醇磷酸盐缓冲液系统是在反相C18柱中最为常用的流动相，能更好更稳定的控制溶液的PH，本实验采用甲醇0.02mol/L磷酸氢二钾溶液PH7.0作为流动相标准混合溶液色谱图见图(1) 有文献报道，对苯甲酸.山梨酸.脱氢乙酸均通过230nm波长检测。利用紫外分光光度计对脱氢乙酸标准溶液进行全波长扫描，在230nm 及290nm 处均有最大吸收，大量试验表明，不同基质的样品对色谱图有不同程度的基线干扰，293nm波长的色谱图基线平滑，优于230nm 波长的色谱图，两者计算的检测限无明显差别，因此，本法沿用国家标准GB/T23377-2009和 GB/T23495-2009的方法，脱氢乙酸通过293nm 波长检测，苯甲酸山梨酸及糖精钠通过230nm波长检测。3.2 提取方法的选择样品中蛋白质及脂肪含量的高低直接影响检验结果的准确性及色谱柱的使用寿命，因此，沉淀蛋白质成为样品前处理的首要考量 常用的沉淀蛋白质方法有盐析法 有机溶剂沉淀法重金属盐沉淀法及生物碱试剂沉淀法等，其中亚铁氰化钾乙酸锌溶液是最常用的蛋白质沉淀剂，具有沉淀快速，滤液澄清的特点，然而大量实验证明，除样品本身外，沉淀剂自身会产生大量絮状沉淀，对目标物有不同程度的吸附作用，从而使样品回收率很难达到要求 本法采用0.3%盐酸乙醇溶液作为提取溶剂，在酸性条件下，各组分都以分子状态存在，易溶于乙醇中 。乙醇具有沉淀蛋白质