甜酒曲中根霉糖化酶菌株的紫外诱变选育-综.doc

甜酒曲中根霉糖化酶菌株的紫外诱变选育实验名称：实验一工业微生物菌种分离一，实验目的：1加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；2学会常规选种方法；3树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二，实验内容：甜酒曲中根霉糖化酶菌株的分离纯化三，实验原理：根霉能产糖化酶，脂肪酶，血纤维蛋白溶解酶等酶系。甜酒曲主要用于制作甜酒酿，在甜酒酿制作过程中，甜酒曲是主要的发酵制剂。甜酒曲是糖化菌及酵母制剂，其所含的微生物主要有根霉、毛霉及少量酵母。 根霉的菌丝无隔膜、有分枝和假根，营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成圆形的孢子囊，囊内产生孢囊孢子。孢子囊内囊轴明显，球形或近球形，囊轴基部与梗相连处有囊托。根霉的孢子可以在固体培养基内保存，能长期保持生活力。菌落疏松或稠密，最初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝匍匐爬行，无色。假根发达，分枝呈指状或根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍弯曲，24株成束，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色，长2102500m，直径518m,囊轴呈球形或近球形或卵圆形，呈淡褐色，直径30200m囊托呈楔型。孢子囊呈球形或近球形，老后呈黑色，直径60250m抱囊抱子呈椭圆形、球形或其他形，呈黄灰色，直径58m有厚垣饱子，其形状、大小不一致，未见接合抱子。该菌于3740能生长。可采用稀释涂布法和平板画线法进行分离。稀释涂布法原理：稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。平板画线分离法原理：平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表点击此处添加图片说明面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 四，实验步骤： 马铃薯蔗糖培养基的制备马铃薯 200g蔗糖 20g自来水 1000mL琼脂 20gpH 自然（约6.0）马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，用纱布过滤，滤液加糖加琼脂，溶化后补足水至1000ml，装入三角瓶。培养基凝固前，在无菌条件下，倒装于9个无菌培养皿中，制成平板培养基。2.无菌器材的准备各种类型的移液管若干；第一轮需要7支1ml移液管（至少），1支10ml移液管，普通培养皿若干；第一论需要9个培养皿；第二轮需要3个培养皿（配置培养基）无菌生理盐水若干；（氯化钠 8.5 g；蒸馏水 1000 ml；121高压灭菌15min）试管；第一轮需要6支试管；第三轮（约4天）天后需要3支试管用于斜面接种培养（配置培养基）锥形瓶。3.菌悬液的制备准确称取1.0000 g甜酒曲于装有9 ml无菌生理盐水的锥形瓶中，盖上瓶塞，轻轻摇匀，备用。（1ml移液管1支，装有9ml无菌生理盐水的试管1支）4.稀释将制得菌悬液，以10倍梯度稀释，依次得到各个稀释度的菌悬液。（需要1ml移液管5支，5支装有9ml无菌生理盐水的试管，1支10ml的移液管）5.稀释涂布接种培养在培养基中加入0.1%去氧胆酸钠溶液，以抑制根霉的过快生长。选取,3个稀释度的菌悬液进行接种，用涂布平板法进行接种。在无菌操作条件下从的稀释液中各取出各0.2mL 涂布于马铃薯培养基的培养皿中，每个稀释度接种3个培养皿。贴好标签，将接种好的培养基在30培养2d。（需要9个无菌培养皿，前面用过的2支移液管可以重复用，还需额外1支无菌移液管）6.初步鉴定培养结束后，进行菌落观察和显微镜检，根据菌落形态和个体形态来识别根霉。菌落形态：菌落的大小，菌丝的高矮，生长密度，孢子颜色以及菌落表面。个体形态：制水浸片观察。制水浸片观察：于洁净的载片中央，滴加一小滴乳酸石炭酸溶液，然后用接种针从菌落边缘挑取少许菌丝体置于其中，使其摊开，轻轻盖上盖片（注意勿出现气泡），置于1010倍数下观察。观察菌丝是否有横隔，假根，匍匐枝，孢子囊梗，孢子梗及胞囊胞子。7.平板画线接种培养在步骤6的培养皿中，找到长势最好的3个目标菌落，用接种环在挑取菌落生长形态良好，菌落颜色为白色的根霉，在无菌操作条件下，用接种环在已配置并灭菌过的培养基上进行划线，运用平板划线分离法对根霉进行接种。每个目标菌落平板画线3个平板，贴好标签，将接种好的培养基在30培养2d。（需要3个培养皿）8.初步鉴定糖化力用碘液在步骤7中培养后的培养基上进行涂抹，根据菌落周围是否出现透明圈来区别产酶菌株。根据HE值大小来初步判断糖化力的强弱。其中，9.斜面接种培养在步骤8中，通过HE值的大小选出产发酵力最强的3个菌落之后， 在无菌条件下用接种环分别接种在12个斜面培养基中备用。（需要12支试管，一定量的培养基）（用作第二步和第三步初期用）五，结果及讨论1结果2讨论实验名称：实验二、工业微生物菌种复筛一，实验目的：1、学习发酵菌种的复筛方法；2、从已分离到的微生物中找出具有工业应用前景的菌株。二，实验内容：通过摇瓶培养（是否也要加入抑制剂）对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。实验原理： 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是46, 温度范围是4060）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解1，4糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。 碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化所产生的C6H12O6 的含量。2.1 I2 与 NaOH作用:I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O2.2 C6H12O6 与NAIO定量作用:C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NAI2.3. C6H12O6反应完后,剩余的NAIO在碱性条件下发生歧化反应:3 NaIO=NAIO3 +2 NaI2.4 歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2:NAIO3 +5NAI +6H2SO4=3I2 +6NA2SO4+3H2O2.5 析出的I2 可用标准NA2S2O3 溶液滴定之:I2 +2NA2S2O3 =NA2S4O6 +2NAI三，实验仪器试剂试管；（第一轮需5支；第二轮需试管10支）1000ml烧杯1个；恒温水浴锅；25ml酸碱滴定管；（一副）100ml锥形瓶；（第一轮需9个锥形瓶；第二轮需尽量多的锥形瓶）1ml移液管；（第一轮需数支）实验步骤：1、发酵培养基的配制；马铃薯蔗糖摇瓶培养基的制备马铃薯 200g蔗糖 20g自来水 1000mLpH 自然（约6.0）马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，用纱布过滤，滤液加蔗糖，溶化后补足水至1000ml，装入9个250ml锥形瓶中（装载量不超过25ml），然后灭菌。2，0.1mol/L溶液。3，0.5%可溶性淀粉。4，2%可溶性淀粉。5，0.2mol/L pH 4.6 醋酸钠缓冲液。6，0.1mol/L碘液。7，0.1mol/L NaOH溶液。8，2mol/L硫酸溶液。 9、目的菌株的摇瓶（或锥形瓶固态）培养； 拿出实验一中的3支斜面培养基试管（已经长出菌落）。在无菌条件下，用无菌生理盐水洗出孢子，得到孢子悬液，调节浓度到个/ml，每支斜面培养基洗出的孢子悬液接种3个摇瓶在，塞上棉塞，贴好标签，共9个摇瓶，进行摇床培养2天。10、发酵液的生理活性测定。10.1 过滤发酵液对9个锥形瓶中的发酵液进行过滤，收集滤液，装入9个烧杯中，并标好标签，备用。10.2 预热取10个带塞的并已编号的试管（与锥形瓶编号对应）分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 水浴中预热10min。10.3 反应每支试管加入过滤后的对应编号烧杯中的发酵液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40 情况下，反应10min（时间可能延长）；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。10.4 预滴定由于每1支斜面培养基试管里的根霉对应接种有3个锥形瓶，所以每组锥形瓶中任选一个锥形瓶进行预滴定，得到硫代硫酸钠溶液消耗量。预滴定操作和下面的正式滴定操作一致。10.5 正式滴定取上述（10.2步骤）反应液5ml于锥形瓶中，加入0.1mol/L碘液5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意:加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）；平行滴定3次，并记录相关样品消耗量。10.6 产酶活力计算酶活力单位（U/ml）=（BA）（） 180.1（）2（） 式中: B空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）； N硫代硫酸钠的当量浓度。 180.1葡萄糖的摩尔质量。 8/5表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。 2所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。 60/10表示酶反应时间为10min，按定义为1h。四，结果及讨论1、结果酶活各平均值平均值得到酶活最高菌株斜面培养试管1摇瓶11次滴定2次滴定3次滴定摇瓶21次滴定2次滴定3次滴定摇瓶31次滴定2次滴定3次滴定空白斜面培养试管2摇瓶11次滴定2次滴定3次滴定摇瓶21次滴定2次滴定3次滴定摇瓶31次滴定2次滴定3次滴定空白斜面培养试管3摇瓶11次滴定2次滴定3次滴定摇瓶21次滴定2次滴定3次滴定摇瓶31次滴定2次滴定3次滴定空白2、讨论实验名称：实验三、微生物的诱变选育一、实验目的学习掌握微生物紫外诱变育种的方法，通过紫外诱变处理，改变根霉菌基因型，分离出具有优良性能的变异株，然后应用到发酵生产中。提高根霉糖化菌的生长特性，具备有耐复杂环境因素的能力，提高糖化发酵的能力，提高甜酒生产的质量，改善我们的发酵生产工艺条件等。二、实验内容用紫外线对实验二所得的菌株进行诱变，观察紫外线对根霉菌产生糖化酶的诱变效应，并对诱变后的菌株进行筛选。三、实验原理紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，根据菌种特性来选择紫外照射剂量，死亡率控制在50-80为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。本实验通过紫外照射甜酒曲中根霉糖化菌，使其发生突变，经过筛选菌种，确定并分离出具有目的基因型或表现性的变异株，然后进行菌种测定评估，观察其在工业生产上的接受性，然后保藏菌种。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应该在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛放菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。四、实验材料1. 药品：无菌生理盐水、 土豆、葡萄糖、琼脂。2. 仪器 ：紫外诱变仪、天平、高压蒸汽灭菌锅。3. 玻璃器皿：10ml移液管、1ml移液管数支、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。4. 其它物品： 盐、药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸。5. 实验一和实验二中用到的药品器材。五、实验步骤（一）培养基制备与无菌器材准备1、土豆培养基：马铃薯200g 蔗糖20g 琼脂1520g 水1000mL将200马铃薯去皮切碎，放入1500ml的烧杯中煮沸30min.注意用玻璃棒拌以防止糊底，煮烂后双层纱布过滤取得土豆汁，加入20g蔗糖，加热煮沸加入琼1520g，加水至1000mL，121灭菌。2. 灭菌操作将待灭菌的培养基、生理盐水、试管等放入蒸气灭菌锅内灭菌。注意：打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后3 min再关紧放汽阀，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持121灭菌20-30min。（二）、菌悬液制备取出1支筛选出的目标菌株，然后用无菌生理盐水洗出孢子（具体咋个洗），然后装有1mL 0.lmol/L pH6.0的无菌磷酸缓冲液（或无菌生理盐水）的三角瓶中(内装玻璃珠约20粒)，30振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬液。用血球计数板调其菌浓度为个/mL，冷冻保藏备用。调浓度具体操作：为得到个/ml的菌悬液，反推出在血球计数板上我们要计数的位置的大概数量，然后再对得到的孢子悬液进行适当稀释（比如先稀释10倍试试看），最终调整浓度为个/ml。最后根据得到的个/ml的菌悬液稀释得到多支个/ml的菌悬液。（三）、致死曲线的测定 将1支试管中个/ml的孢子悬液，连续10倍系列稀释4次，得到个/ml的菌悬液，这时用移液管吸取0.2mL各涂布3 个马铃薯培养基平板，把涂布后的培养皿置于30恒温培养2d，作为照射后的对照。打开紫外灯(15W)预热20min，另取7个培养皿（直径9cm）分别加入9ml孢子悬液。启动磁力搅拌器，照射距离为30cm左右。 调节搅拌子的转速,转速稳定后，打开平皿盖子照射，并开始计时，照射时间分别为0（前面已做，不在做）、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s。 照射后，从第1、2个平皿中取出0.1mL的孢子悬液，稀释，吸取0.2mL 各涂布 3 个DPA 培养基平板；从第3、4个平皿中取出0.1mL的孢子悬液，稀释，吸取0.2mL 各涂布 3 个DPA 培养基平板；从第5、6个平皿中取出0.1mL的孢子悬液，稀释，吸取0.2mL 各涂布 3 个DPA 培养基平板；从第7个平皿中取出0.2mL 各涂布 3 个DPA 培养基平板（上面这一系列稀释可以作适当调整）。把涂布后的培养基置于30恒温箱培养(为避免光复活，平皿需用黑纸或牛皮纸包裹) 整个操作过程均在红光下进行, 培养2d后统计菌落数，然后计算致死率，确定诱变时间。经紫外光诱变死亡率达到95% 99% 时的剂量, 往往是回复突变株出现率最高的剂量, 经验表明,