酶定向突变.doc

酶的定向进化及其应用孙志浩，柳志强!（江南大学生物工程学院生物催化研究室，工业生物技术教育部重点实验室，无锡!#$%&）摘要：综述了生物催化剂（酶）分子定向进化的产生、原理、方法及应用，深入阐述酶分子定向进化过程中的相关问题，重点介绍了易错()（*+,+-.+,/0 ()）和123 改组（123 4567789/:）等几种典型的酶定向进化方法与成功实例，展望了生物定向进化研究的发展前景。关键词：生物催化剂；蛋白质工程；非理性设计；定向进化；易错()；123 改组中图分类号：; 文献标识码：3 文章编号：&! = %&（!$?）$% = $ = $基金项目：国家X% 项目（!$%(J）、国家自然科学基金项目（!$# 月生物加工过程(59/040 Y,6+/C8 ,7 J9,.+,K044 */:9/00+9/:36: W !$? !#$%&(）方法应用于定向进化过程中)，*，为定向进化的理论及应用研究奠定了基础。目前，酶的定向进化主要在以下几个方面开展工作：在非自然或极端环境中（此时生物催化剂的活性和稳定性极低）生物催化剂稳定性和功能的提高；对新底物催化活性的提高，特异性的调节（尤其是对映体选择性）以及在异种宿主中功能表达能力的提高+。引用加州理工学院从事定向进化研究的生物化学家弗朗西丝阿诺德女士对定向进化的解释可以对该方法有进一步的认识：“定向进化是物种进行选择的一个高技术版本，是在分子水平上的繁育。研究的对象不是整个机体，而是特定的基因或蛋白质”,。! 定向进化的原理及目的定向进化是利用-./ 012 多聚酶不具有34!54校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化酶基因的678 扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质优化的酶，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是：“获取所筛选的突变体”9:。简言之，定向进化就是随机突变同选择或筛选相结合。与自然进化不同，定向进化是人为引发的，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。酶分子定向进化的目的在于，人为地改变天然生物催化剂的某些性质，增强在不良环境中的稳定性，创造天然生物催化剂所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，产生新的催化能力，扩大生物催化剂的应用范围。 定向进化中突变文库的构建方法突变体的量、突变基因文库建立的简便性、建立突变基因文库方法的可操作性在很大程度上影响着进化研究的效率，随着定向进化技术在酶分子改造领域所展现出的其他方法不可取代的优势，研究者设计了多种用来建立突变基因文库的方法，根据创建突变基因文库方法的不同可将它们大致分为非重组型和重组型，简介如下。; /#?&.% ABCA 678）策略。即将一次678扩增得到的有用突变基因作为下一次678 扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。7（陈克勤）等人用此策略使在非水相（二甲基甲酰胺，0DE）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶F 的活性获得成功，所得突变体673 在):G的0DE 中，催化效率比野生酶高H*9 倍9H，95。易错678（FABCA 678）是非重组型构建突变文库的方法。由于普通的-./ 012 聚合酶不具有34!54 外切酶活力，在扩增过程中不可避免的发生一些碱基的错配。在扩增体系因素发生改变如改变D(; I 浓度或使用D; I 代替了D(; I 作为012 合成酶的激活剂时可以使错配率提高。易错678 方法由J#( 等于9,+5 年首次设计并报道，9,; 年由7%.KL% 和MANO 对其进行完善93。在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化（.=P#.% QA%#?&A）。使用该方法易出现同型碱基转换。易错678 只能使原始蛋白质中仅有很小的序列空间发生突变，因而一般适用于较小的基因片段（ R +: SC）。但对于初涉定向进化的研究者，易错678 不失为一种有效、实用的进化方法9)。; P#.% 678），是基因在分子水平上进行有性重组（=P#.% OATS&.?&A）。该方法由=?TT 于9,H 年引入到蛋白质的定向进化过程中，并成功地改造了数十种具有工业用途的蛋白质。该方法通过改变单个基因或基因家族（($.T&%N）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。012 改组策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。在理论和实践上，它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错678”。通过012 改组，不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。在012 改组过程中能以较低的和可控制的几率引入了点突变，同时它允许发生单一突变和较大的012 片段的突变（图9）。外显子改组（PA =#$%&(）类似于012 改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，与012改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而012 改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。外显子改组更适用于真核生物，并 + 生物加工过程第3 卷第3 期可获得各种大小的随机肽库。图! #$ 改组原理与流程图%，&，()*+! ,-)./)012 3.4 0-5/246-2 57 #$ 896771).*随着研究的不断深入，#$ 改组技术也在不断的改进!。目前，利用#$ 改组已成功进化了编码!:内酰胺酶、!:葡萄糖苷酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶和;:?）。现已发展了家族改组! !=以及使用单链#$ 作为改组模板的#$ 重组技术，以弥补传统#$ 改组方法的缺点。A +B 定向进化的其他方法随着酶分子定向进化的发展，在常规的定向进化方法的基础上，又相继开发出了一些定向进化的新方法，如体外随机引发重组（-3.45C 0-)C).* ! #!$%&-2/5CD).3;)5.，,、不依赖于同源性的蛋白质重组方法（82E62./2 95C515*F:).4202.42.; 0-5;2). -2/5CD):.3;)5.，GHI,JK）A!、交错延伸（8;3*2- 2L;2.8)5. 0-5:/288，G;J,）AA、过渡模板随机嵌合生长（ -3.45C/9)C2-3*2.28)8 5. ;-3.8)2.; ;2C013;28，$KHIMM）、渐增切割产杂合酶方法（)./-2C2.;31 ;-6./3;)5. 75- ;92 /-2:3;)5. 57 9FD-)4 2.NFC28，IMKHO）AB以及酶法体外随机:定位诱变（-3.45C:8);2:4)-2/;24 C6;3*2.28)8）A% A&等方法，应用这些新方法已经有相当一部分成功的例子，但仍没有易错,K。筛选是在一个文库中有其它成员存在的条件下确认一个目的成员的过程，是将库中的每个个体进行活性调查，如果从表型上不能区分活性，则只能随机进行逐个测试。“选择”是在文库中仅仅有目的成员表现出来，如一个可见的目的微生物克隆，因为它仅仅允许含有的编码一个特殊酶基因的微生物生长，这种所谓的体外选择通常是很有效的。在定向进化中，尽管突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，同时控制实验条件来限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，也加快了生物催化剂在某一方向的进化速度。筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。生物催化剂改造中常用的筛选方法如表!。高通量筛选为从基因改组和杂交实验得到的众多突变体中找到性能改良的生物催化剂提供了可能，这些高通量筛选方法包括细胞表面展示技术BA、噬菌体表面展示系统BB，B%、核糖体展示技术BR等，其中噬菌体展示技术是一种进行体外选择的有效的方法，在研究中已有很多成功应用的例子B& BP。用噬菌体展示技术，核糖体展示技术或细胞展示技术通量高但是通用性差，只能对结合能力进行筛选。目前最好的筛选方法是基于生色底物或荧光显色B=，以及产物的一些物理化学性质等% %A，筛选的数目大概是!R。R 年P 月孙志浩等：酶的定向进化及其应用 = 了一种通用的水解酶荧光底物测活方法。由不同前体水解产生氨基和二醇，高碘酸钠原位氧化，再以牛血清白蛋白催化!消除反应，产生荧光产物。这种方法的用途可以很广，各种酰胺水解酶、磷酸酯酶、脂肪酶、酯酶和环氧化物水解酶都可以用这种方法检测#。策略选择是高通量筛选的首选方法。“选择”仅仅允许含有编码一个特殊酶基因的微生物进行生长，在文库中仅仅有目的成员表现出来，没有活性或者活性不够高的个体无法存活，因此真正模拟自然进化，体现了物竞天择，适者生存的道理。选择的主要优点是不符合要求的个体根本不出现，可以同时分析多得多的库中个体。例如高温下一个可见的嗜热微生物克隆。由于特定选择系统控制的微生物细胞是极其多样的，因此建立一个通用的选择系统往往是不那么容易的，而且有可能产生假阳性或假阴性。当这种现象很严重时，就需要建立更有效的筛选方法。酶分子定向改造中常用的策略选择方法简介如表$。表% 酶定向进化中常用的筛选方法#%&()* % +,-*./ 01-*.2.3 .4 0*)*1/25. 6*/7540 ,0*4 2. /7* 42!-*1/*4 *.896* *:5/25.方法类型终点动态分布图产色素; 荧光薄层色谱法有色物质或产物产物染色产色素!荧光反应物; 生成物?A& 酶联免疫吸附测定间质片层反应物分析工具高压液相色谱质谱仪+ 鸟嘌呤和胞嘧啶=5653*.*5,0 1/B !CDAE 红外线温度记录仪FGH 折叠基因报告表$ 酶分子定向改造中代表性的选择方法#%&()* $ C4*./2I21/25. 6*/7540 -*-*.0*./2:* 2. /7* 42-*1/*4 *.896* *:5),/25.方法选择策略特征生长的选择性物质能够降解化合物降解物质成为生长需要的元素如J、+、A自养互补作用恢复代谢功能强阳性选择噬菌体展示结合展示病毒表面的肽或蛋白质，依据结合亲和性来分离+E& 折叠报道基因抗生素抗性通过氯霉素乙酰转移酶融合标签，正确折叠的蛋白质对有机体产生抗生素抗性! 定向进化的应用定向进化在其出现的短短的十几年内已发展成一门相当成熟的蛋白质及多肽的改造技术，它的应用极大地促进了酶工程、代谢工程以及医药等其他相关领域的发展。在众多研究者的共同努力下，蛋白质定向进化领域取得了卓著成绩，定向进化应用于工业生物催化剂改造的成功例子已经很多。以下列举几个典型实例。 B% 易错H+K 的应用：在LMG 中枯草杆菌蛋白酶的激活枯草杆菌蛋白酶（0,(/2)202.）在LMG 浓度较高时也很稳定但催化活性不高。即使枯草杆菌蛋白酶分子在一个或两个位点上发生突变，突变酶活力也不会很高。通过易错H+K 建立LJE 突变文库，在每一代中挑选出单个突变体作为下一代的母本。突变基因被连接到质粒上，并转化到大肠杆菌中，用酪素平板法测定其在LMG 中枯草杆菌蛋白酶活，进行突变蛋白质粗筛：在琼脂平板上的菌落周围，枯草杆菌蛋白酶被分泌到培养基中，由于分解酪素而形成了透明圈，透明圈较大的菌落产生的酶活较高。在第一代中尽管只有# 个氨基酸被取代，第个氨基酸通过已知的定点突变体进行互换，在NOP的LMG 中，酶活提高了O 倍。另外六代中每一代筛选上百个菌落，考察的%O 个菌落中与野生型比较，发现酶的进化一代代降低，这种简单的获得新枯草杆菌蛋白酶的方法并不能保证得到最好的酶。+7*.（陈克勤）等%，%Q用易错H+K 改造枯草芽孢杆菌蛋白酶，变异体在NOP和RQPLMG 中的催化效率!1/ ; !6 比野生酶分别提高了$QN 和%#%倍，比活力提高了%QS 倍。在此基础上再进行两轮易错H+K，筛选得到的突变体在NOP二甲基甲酰胺中又提高了# 倍，比野生酶高S% 倍。 B$ LJE 改组的应用：对硝基苯酯酶基因重组)2 C2)9 公司利用对硝基苯酯酶水解LMG 中!内酰胺化合物中对硝基苯酯，而对有锌盐和纯粹的有机途径不感兴趣。因此要寻找可以水解酯的酶。由于在自然界中可以水解酯的酶不能在LMG 中水解抗生素，他们用已有的活性较低的酶作为定向进%O 生物加工过程第# 卷第# 期化的起始酶。野生型酯酶并不能被分泌，也没有任何简单的测量检验方法。为了避免用!#$ 筛选成千的菌落的强度，首先寻找水解反应后可以产生对硝基苯酚的对硝基苯酯酶，而对硝基苯酚在%&孔平板上可利用比色测定。随机$( 突变后的四代中可筛选出) *个菌落，发现)+, 的-./ 中酯酶的酶活提高了)+ 倍，第四代后，收集了&0 个克隆子，用来考察对硝基苯和对硝基苄酯酶酶活间的交互作用。利用-12 改组，在仅筛选的0* 个菌落中有3 个克隆子，它们的活力至少比亲代基因的酶活提高了4* 倍。0 56 酶的稳定性和活力的提高在微生物拆分泛解酸内酯的实际应用中发现：随着催化反应的进行，反应体系中的中性-泛解酸内酯被-泛解酸内酯水解酶水解成酸性的-泛解酸，导致反应体系中的酸性增强，7! 下降迅速。由于野生型的-泛解酸内酯水解酶最适催化7! 为8 5*，当7! 低时耐受能力差，因此酶的催化活力也随之下降。为了使酶促反应能够顺利进行，必须向反应体系中持续的流加氨水，以使反应体系维持在酶作用的最适7! 范围内，否则，酶促催化反应几乎不再进行。另外，正常催化条件下，野生型-泛解酸内酯水解酶的酶活力也需进一步提高。为了解决以上问题，笔者研究小组利用易错$( 和-12 改组组合方法对-泛解酸内酯水解酶进行了定向进化研究00。经过三轮易错$( 和一轮-12 改组，以酶活力和7! 稳定性为指标，对约8 5+ 万株突变体进行筛选，最终获得一株酶活力高、且在低7! 条件下稳定性好的突变株.9: ;3&)。该突变株的酶活力是野生型酶的+ 5+ 倍。对突变体和野生型酶在7! & 5*和7! + 5* 条件下的残余酶活进行对比，在这两种7! 条件下，突变体酶的酶活残留分别为8+, 和+*,，而野生型酶只能保持原来的0*,和4*,。通过软件-12.21 对突变体.9: ;3&) 酶基因和野生型酶基因进行分析对比，发现突变体.9: ;3&) 酶基因发生了三处点突变，其中突变使两处氨基酸取代，即)3 位的?，另一处为沉默突变，未引起氨基酸的变化。0 50 对映体选择性的提高用定向进化提高生物催化剂的对映体选择性是解决手性物质纯度低的一个很有潜力的方法。乙内酰脲酶 氨基甲酰酶不能大规模地应用于生产对映纯#氨基酸的一个主要原因是乙内酰脲酶没有足够的对映体特异性，它的特异性随着底物上的+A取代物而变化。当筛选不到较好的#型乙内酰脲酶时，则采用定向进化改造乙内酰脲酶的对映体选择性。4* 年.BC 等用易错$( 和筛选方法，提高乙内酰脲酶转化底物的异构选择性，全部活性提高了6 倍%。用这种方法，可快速实现对映体选择性的转化。仅有两个有效氨基酸残基发生取代时，就表现出对称选择性上的显著差异，一个突变体在对映体过量值为%*, ! 5 ! 5 时产生-型对映体，而另一个#型突变体在对映体过量值为0*, ! 5 ! 5 时则产生4*,的相反的对映体产物，尽管#型酶活力不显著，但提供了进一步改造的空间，已经证明在吨级生产规模上使用简单的间歇反应器和连续离心细胞分离，使酶活得以提高。! 酶分子定向进化的发展与展望酶分子定向进化最初的尝试始于4* 世纪&* 年代，DEF D7GHIHFJBK 成功地再分子水平上定向改造了(12 噬菌体复制酶=，模拟了自然进化过程，但当时他们进行该实验的目的只是为了证明达尔文的自然选择可以发生在生物体外，由于没有太大的实际应用价值，因此该实验没有受到重视。-12 改组方法最初是LEKH 在)%33 年研究小鼠同类株组织相容性基因时提出来的，)%0 年D:HJJHM 将其引入到酶分子定向进化中&，8。利用-12 改组方法D:HJJHM 对!内酰胺酶进行了改造以向培养物中添加头孢氨噻为选择压力，经三轮-12改组和筛选得到了酶活力提高64 * 倍的突变体。)%0 年D:HJJHM 在1B:9MH&和美国科学院会刊+上发表了自己的研究成果，随后他将-12 改组在蛋白质定向进化中的应用申请了专利，并以该技术为基础平台建立了专业性的从事定向进化的公司（N:7： OOO5JBPCIHK5 QEJ GKRHPB5 7N7），据该公司称目前他们已经完成了数十种蛋白质的定向进化，并有部分实现了商业化。另一个在定向进化领域比较突出的是加州理工学院弗朗西丝阿诺德（/MBKQHS!52MKEFR）研究小组（ N:7： OOO5 QNH5 QBF:HQN5 HR9 IME97S TNB）。该研究小组最初利用易错$( 技术并结合筛选实现了枯草杆菌蛋白酶; 在大肠杆菌中的表达量和在有机溶剂反应体系中的酶活力的提高，在随后的研究中该小组又对枯草杆菌蛋白酶的热稳定性进行了改造。该研究小组还提出了一些其他种类的定向进化的方法如体外随机引发重组4&、4*+ 年3 月孙志浩等：酶的定向进化及其应用) 交错延伸!等。以上两个研究小组在定向进化领域一直比较活跃，发表了大量的研究论文，为其他研究者提供了很多有价值的经验和可借鉴的方法。国内进行定向进化研究的起步较晚，最初进行这方面研究的是吉林大学酶工程教育部重点实验室张今研究小组!#，!$，他们以天冬氨酸酶为模型提出了一种酶法体外随机%定位诱变的改造酶的方法，该方法通过控制&( 合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配，对目的基因既采用随机突变增加突变位点，以快速产生优质酶，又使其突变受到一定限制，以减少筛选突变体的工作量。利用该方法他们对天冬氨酸酶进行了成功的改造，提高了天冬氨酸酶的活力。笔者研究小组用易错)*+ 和&( 改组组合方法，结合两步法筛选系统，对&%泛解酸内酯水解酶进行了定向进化，取得了很好的效果#。国内许多高等院校与科研院所的研究小组也相继开始了蛋白质定向进化方面的工作。实验证明：定向进化不仅可以应用于生物催化剂活性、热稳定和耐操作条件性能的显著提高而且还可以应用到疫苗和制药领域，对疫苗和蛋白类药物进行改造#$，#,，在各个应用领域，定向进化都取得了显著成功#-。定向进化为生物催化剂从实验室研究走向工业应用提供了强大的手段。目前，对一些酶（ 或蛋白质）、砷酸盐解毒途径#、抗辐射性#.、生物合成途径$/、对映体选择性$0、抗体库$!以及&( 结合位点定向进化$1的可喜成果令众多的相关领域的科学家为之振奋。可见，进化能发生在自然界，也能发生在试管中，它与合理设计互补，将会使分子生物学家更加得心应手地设计和改造酶（或蛋白质）分子，将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景$#。参考文献：0 +234567 &8 )9:;45 5645 ? 34:452A;94?B C:45; := D4EF8*299 GC45 H4:;I7，0.-，：#0-%#! 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