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PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。这里还需提醒的是3端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四种dNTP各200mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20，AG和CC错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。寡核苷酸的优化设计郑仲承( 中国科学院上海生命科学院生物化学和细胞生物学研究所，上海 200031 )在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(G)来表示。现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都在25 条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：此主题相关图片如下：G(kcal/mol)例如，双链d(ACGGCCGT)的G是：G(ACGG)G(AC)G(CG)G(GG)()8.0 kcal/mol此计算方法特别适用于测定其3末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的G。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcalmo1。2. 选择引物的一般规则设计和选择引物时有5个要素必需注意。2.1 引物的3末端不互补引物的3末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3末端双链的G是02 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在6时只有40%，到8时少于20%，而10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。2.2 引物分子内不互补应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其G为3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5末端对反应就没有多大的影响了。2.3 引物的组分、解链温度和长度普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减少这种问题。2.4 引物的内部稳定性在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定(如GC含量较多)，而3末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。如果用3末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。所以，有时3末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3末端最后5个核苷酸的稳定性小于9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3末端越不稳定，假引发的可能性越低。2.5 引物的唯一性为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3末端往往都有67个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重复(如ATATAT)。3. 按照氨基酸序列设计寡核苷酸按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段，尤其是在试图“钓取”一个蛋白质的基因时。此时要注意的问题有：(1)宁可用简并引物，也不用猜测的引物。氨基酸密码子的简并性给予引物设计以可塑性，这比用猜测的密码子要好得多。有人用1 024个简并引物得到很好的结果。但是，应当避免在一个区域内有很高的简并性。但也有简并性低使引物不工作的报道。(2)引物与模板的错配。一般认为，所用引物与模板有15%20%的错配，PCR的效果还能接受。但是，引物3末端的错配比同样错配率的5末端错配会引起更严重的问题。在最后4个碱基中有2个错配的引物，其 PCR产量急剧下降。但是，当核苷酸浓度高时，3末端有错配的引物还能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8 mmol/L时，大多数3末端错配引物可以接受，虽然非专一产物比较多，DNA合成的忠实性也下降。即使在低核苷浓度下，还会有少量从错配碱基出发的合成，因此，在开始的PCR循环中把退火时间增加到35分钟，比之于用标准退火时间和高浓度核苷酸能够产生质量更好的所求产物。(3)在用唯一性引物时，建议用0.2 mmol/L或更低的总核苷酸浓度，因为高浓度会增加错误参入的比率。(4)简并寡核苷酸时，PCR应当在比较高的引物浓度下进行，即13 mol/L而不是0.2 mol/L，因为在反应混合物中的大多数寡聚物并不是被用来引发专一的反应，而只是产生高的背景而已。推荐使用Primer Premier 5.0作者：LiFeng下载的安装文件有4M, 安装后运行该软件, 屏幕上方是最基础的工具条,如 File, Edit, View, Search 等等, FILE下拉菜单中包括New Sequence(Protein or DNA), Open Sequence( Protein or DNA), save, save as, Degenerate Bases, Print, Exit。EDIT下拉菜单中除包括常用的Copy, Cut, Paste 之外,还有一项Preference可以设定默认引物长度等参数。其余View, Search, Function, Translate 等其他的功能,基本上可以在中央的操作框中实现。下面简要介绍一下操作框。 下半部分显示的是一段DNA序列, 可以改变其中的碱基，但DEMO版中不可以，序列上方有一排工具钮, 如下5 Sequence No： 5 到 3 显示DNA序列。实际上该功能确定序列中第一个碱基的号码，可将所处理的碱基在整体中的位置加以确定。Header： 好像是表示这段基因的来源说明。当基因序列来自于各大数据库格式的文件时，显示序列前的其他说明文字。3, 10; 碱基对以 3 或 10 为一单元显示序列。Find, Find next： 寻找一段特定碱基序列.(Search 下拉菜单中还有一项Go to position 可查找指定位置。)S, A, ds DNA： 显示源序列互补序列或双链DNA序列。还有两个与声音有关按钮, 无太大用。在刚输入序列、测序后等对比文件序列与文字序列是否一致时非常重要，可以让一个人轻松对序列。在操作框上方正中有两个按钮; DNA, PROTEIN, 由于我用的是试用版这项功能不能使用, 但很明显这项功能可将已知DNA序列翻译为蛋白质氨基酸序列，或者是反过来。当序列是核酸时，PROTEIN可以操作，将序列翻译成蛋白；而序列是蛋白时，可以进行DNA操作，将蛋白生成对应的DNA序列。这两个键在将表达系统从一种转移到另一种的设计时很有用。在上方的Translate下拉菜单中可以对读码框和密码子进行设定和编辑, 可以设定标准密码子, 也可以设定酵母,植物,脊椎,无脊椎密码子, 还可以添加新的密码表。左上角纵向排列有三个Function按钮： , Primer； , Enzyme； , Motif 。,Primer; 在PCR和核酸杂交中设计引物。点击后出现一新框。中间偏上是DNA序列与引物, 可以用鼠标直接选择引物的位置。序列下方显示了各项参数,还包括发夹结构，二聚体异二聚体在链中出现次数，如没有的话出现NONE钮, 如果存在该结构则为FOUND钮， 点击该钮可以察看该结构出现的具体位置，包括这样引物的特性一目了然。最上方是三个功能按钮 Search results Edit primers Search：搜寻引物,可选择PCR引物,序列引物,杂交探针,可以自己定义在正负链中搜索，搜寻范围,引物长度,PCR产物长度，可选择自动搜索手动搜索,还可设定搜索参数,如Tm, GC, Degeneracy,3 端稳定性, Dimer, Hairpin, 等引物参数。设定完毕点击OK即可得到结果列表,包括所有可能的引物数目,以及各项参数达不到要求筛去的引物,最下方显示的是最佳方案的个数，可以在Result项中详细察看搜索得到的结果。 Result：显示引物搜寻结果列表，可以选定正负链或PAIRS，表中显示了每个引物的位置长度，还可以点击每个引物方案察看其在链中位置及其各项参数,你还可以选择所需要的并标记。Edit primers：可以点击链两侧的左右箭头来选定引物位置，可以任意编辑引物，添加或删除任一个碱基，修改任一个碱基，当你编辑完毕，点Analyze钮就可以察看你编辑的引物的各项参数。,Enzyme： 做序列的酶切位点, 可以应用于基因操作中酶切部位和所用酶的选择。最上方有两个选择：序列分析的范围；酶切位点个数选择（可低于1-6个）。点击后左右两边有一栏酶,左边为所有酶, 右边为选定的酶。中间四个钮分别为：ADD： 从所有酶列表中选定所用酶加入右侧列表,DELETE：从选中酶列表中删除某个酶,EDIT： 编辑酶列表,可以加入新的酶或删除已有酶,FILTER： 如果你不知道该选用那几种酶，可用此功能筛选所需酶, 可用酶切位点BP数（4BP-13BP）和 切割后的接头Overhang ( 3, 5, BLUNT, 还可以具体规定切出的接头为那几个碱基)来筛选。所用酶选好后点OK即可得到酶切结果, 有四种格式：Table： 酶切位点,位置。SEQ; 整段序列及酶切位置。MAP： 与上一项近似。用示意图的方式显示结果。NON Cutter： 切不动的酶,Motif： 查找特定序列, 如 -10区，-35区，AGGA BOX, CAAT BOX, 与基因表达调控有关。最上方有两个选择：序列分析的范围；Motif位点个数选择（可低于1-6个）。左边一栏是所有特定序列，右边是选定的，中间按钮与近似，只是没有FILTER功能。选定你要查找的东西，点一下OK就可以看结果了，与的结果输出一样有四种格式：Table： Motif的位置，数量。SEQ： 整段序列及Motif的位置。MAP： 与上一项近似。 用示意图的方式显示结果。Motif absent： 序列中不存在的Motif。我个人感觉，先用RNA structure模拟一下mRNA结构，选择非发夹结构区，再用Primer Premier 5.0设计引物，设计出来后再用oligo验证一下，这样最保险！不过万一不行的，RNA structure只能是个参考，不要全信，否则很难设计引物而且Primer Premier 5.0有时对antisense的能否有配对等识别不清，oligo可靠！引物由DNA合成仪合成，其长度通常为15-26 个碱基，其使用浓度一般为1umol/L。这一浓度足以完成30个循环反应。引物浓度太高会出现非特异扩增现象，反之，若引物浓度太低，则PCR效率极低。PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但首先应从DNA找出需要的基因序列，确定保守区；然后遵循某些原则进行引物设计，能最大限度地保证PCR的成功。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。如果退火温度设置在近于引物的Tm值几度的范围内，1824个寡核苷酸在标准PCR中能较好的保证特异性。在退火温度54或稍高能保证特异性和有效性的情况下，尽量使引物短；扩增片段异源性较强，如有同工型(ioform)或利用某物种已知基因序列扩增另一物种中基因时，引物可用2835个碱基（至少25个，Tm值大于70）。4.G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳，在标准PCR中Tm值不能低于54。实际Tm值受各缓冲液成分，甚至引物和模板的浓度的影响，所以只能作为一近似值。Rychlik提供的基于最近邻的热力学参数，预测Tm值更准确些。最重要的是一对引物的Tm值（受长度和GC含量影响）应该协调一致。5.碱基随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应有互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。即使在未知序列的PCR中，引物3末端最后5-6个核苷酸的错配也应尽可能的少。如扩增编码区域(根据蛋白序列设计的引物)，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。因此，如果能确定一个保守氨基酸，或将其密码子的前2个碱基作为3末端，若是M和W，则为3个碱基。(还要考虑密码子在该类生物中的保守性)在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四种dNTP各200mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20，AG和CC错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。在不得已的情况下，以T结尾的引物即使与T、G或C错配仍可有效延伸。如果3末端为CC、GG、CG、GC，能提高引发效率。9.引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.在靶序列中的位置若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3末端非编码区域与许多其它mRNA有同源性；尽力把引物放到不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。如果PCR引物必须在特异序列的限定区域内选择，应挑选缺乏单一核苷酸的区域，这样可以减少广范围引物-引物同源的机会。同样也要注意引物对在长度和GC含量上取得平衡以便使两个引物的Tm值相差在2-3范围内。12.待扩增片段序列未知时，其序列内可能包含有引物内所设计利用的酶切位点，可采用识别8个碱基序列的内切酶(Asc I, Not I, Pac I, Pme I, Sfi I, SgrA I,Srf I,Sse8387 I, Swa I)予以解决。13设计引物内的酶切位点靠近DNA末端时，要在引物的5端额外加入几个碱基，便如 HpaII 和 MboI，要求在限制性序列位于5末端前至少有一个碱基(可参考1998/99New Engeand Biolabs Catalog 第258页所附的 Cleavage close to the end of DNA fragments(oligonucleotides)增加额外的碱基)，否则将影响酶切效率。当然，还有许多特殊目的的引物设计就需要按照所要达到的目的进行不同的设计。总之，要掌握两个目的的平衡：扩增的特异性和扩增的有效性。实际扩增时，引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。1 如何测定引物的OD值？用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。2 如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。3 怎样按照使用浓度溶解引物？记住几个参数：在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的溶液定义为1 OD260单位，据此定义，1 OD260引物干粉约为33微克；碱基的平均分子量为324.5；引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量举例：如果您拿到一管标明为2 OD的20碱基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66g摩尔数=66 / 6490 =0.010 mol= 10 nmol若您需要溶解为10M(=10pmol/l)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。4 如何保存引物？可以室温或-20密闭长期保存；溶解以后的DNA最好保存在-20,溶解引物的水的PH值要求大于7，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。5已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。6 为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，是因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。7引物不纯会造成什么后果？引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出现双峰或乱峰。8 普通合成的DNA片段5末端是磷酸基团吗？普通合成的DNA片段5末端与3末端都是羟基，可直接用于PCR。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5或3端进行磷酸化，需要另外收费(参见价目表)。9. 常用标记的荧光染料的波长、可见光中的颜色简称 全称 吸收波长 发射波长 颜色6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm GreenTET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm OrangeHEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm PinkTAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm RoseROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm RedCy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm RedCy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violetfrom:http:/www.lookgene.cc/useful.htm1引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。3引物所对应模板位置序列的Tm值（meltingtemperature）是在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位(thenearestneighbormethod)”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。4碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。5引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。6引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。7G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间G值相对较高，而3端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。8引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。9引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。10引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能。11扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。12引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。总之设计时要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都可以。RTPCR1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%60% c. 5端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3端的错配 g. 避免内部形成二级结构h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM)j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Onlinedesgin et al.* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的 Tm低5。设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5，以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2. stability of primers定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100M。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于10M浓度溶于TE的引物在 -20可以稳定保存6个月，但在室温（15到30）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室温（15到30）最多可以保存 2个月。3. optimize reactants concentrationa. magnesiom ionsMg 离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度，对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液b. 其他的离子NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.c. polymerase不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用9092度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性d. template50ul PCR SYSTEM=human gDNA 0.1ug-1ugE.Coli 10ng-100ngLamadaDNA 0.5ng-5ngPlasmid DNA 0.1ng-10ng=4. termperaturea. denaturation常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturationb. annealing重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.5. touchdown PCR原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子，ANNEALING TEMP. 55度94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s72 1min 20cycles 72 5min6. hot start PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。=ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)Magnesium wax beads (Stratagene).=象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗