DNA的连接.docx

DNA的连接 4.1 实验原理 4.1.1 DNA的连接策略 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： （1）互补性粘性末端的连接 单一限制性内切酶或两种限制性内切酶（为同尾酶，如BamHI和BglII）分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：31：10之间。同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。而带5端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后该种缺口可在DNA复制过程中自动修复。 （2）非互补粘性末端的连接 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这DNA重组中最容易克隆的DNA片段。一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）通常为为1：1。 （3）平头末端的连接 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG 8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 4.1.2 DNA连接酶类型 能用于连接DNA的酶有2种：大肠杆菌连接酶和大肠杆菌T4噬菌体所编码的T4-DNA连接酶。前者的反应需要NAD+参与催化，而T4连接酶的反应则需要ATP参与催化。最初的研究表明，大肠杆菌连接酶只能催化粘端的连接，现在发现在PEG或聚蔗糖存在的条件下，也能进行平端的连接。相比较而言，T4-DNA连接酶并不需要PEG等的存在就能进行平端的连接，所以现在实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。 4.1.3 DNA连接的影响因素 连接反应的影响因素包括温度，时间，酶量，缓冲体系，DNA末端的性质（见4.1.1）及浓度，DNA片段的大小等。 （1）温度与时间 连接反应的一项重要参数是温度，理论上连接反应的最佳温度是37，此时连接酶的活性最高。但37时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即1216。一般粘性末端的连接在此温度下，反应30min即可取得较好的效果，如时间充裕的话连接60min则更完全些，为了实验方便有时也在4条件下连接过夜。而对于平头末端的连接，建议在37条件下连接，并且时间适当延长。 （2）酶量 酶单位的定义在宝生物工程公司提供的T4-DNA连接酶中是指在20ml的连接发应体系中，6mg的l DNA-HindIII的分解物在16下发应30min时，有90%以上的DNA片段进行连接的酶量为1U。由以上的定义可知，日常连接实验中的DNA的浓度比酶量定义的状态下低很多1020倍，所以实际酶量是过量的。平头末端的连接酶的用量要比粘性末端连接所需酶量大10100倍，因此厂商提供的连接酶浓度往往是高浓度的（宝生物的T4-DNA连接酶浓度350U/ml）。故从这个意义上分析，常规的粘性末端的连接反应体系中酶量的加入往往是过量的。 （3）缓冲体系 不同公司的连接酶缓冲液大部分含有Tris-HCl（pH 7.5）提供连接所需的合适pH值。另外在缓冲液中还有两种主要成份非常重要：DTT和ATP。前者提供一定的还原能力，而后者能促进连接反应的有效进行。但是在实验中缓冲液使用时的反复冻融会引起ATP的分解，从而影响连接效率。为了保证实验的顺利进行，一般大剂量的缓冲液可以分装成小管保存并使用，另外可考虑使用一段时间的缓冲液定期更新一下。 （4）DNA浓度 DNA连接反应中建议的DNA连接浓度为0.11pmol/ml，而为了降低载体分子间的环化，载体DNA的浓度不宜过高，外源DNA的投入量则依据连接类型不同投入110倍。 4.2 试剂与器材 1. 试剂 （1）外源DNA和载体DNA （2）T4-DNA连接酶 2. 器材 （1）eppendorf管、枪头 （2）移液器 4.3实验步骤 4.3.1 常规DNA分子的连接 （1）用适当限制酶消化载体质粒和外源DNA，必要时用琼脂糖凝胶电泳分离片段。 （2）载体DNA取A ml，外源DNA取B ml，充分混匀后于42保温10分钟后，迅速冷却到0（可省略，热脉冲是为了提高两种DNA分子碰撞的概率）。 （3）再按设计的反应体系依次加入：10T4-缓冲液，T4-DNA连接酶。 （4）置于16连接1h以上，待用。 建议连接体系（可根据样品浓度进行适当调整）： ddH2O（ml） 外源DNA（ml） 载体DNA（ml） Buffer（ml） Enzyme（ml） Total（ml） 13-A-B B A 1.5 0.5 15 4.3.2 PCR产物与T-载体连接 （1）回收的PCR扩增产物直接与pMD18-T载体连接，连接反应按如下： 5Buffer pMD18-T PCR产物 T4-DNA ligase 2ml 0.5ml 7ml 0.5ml 10ml （2）16连接1h以上，用于转化。DNA连接反应的影响因素1、 连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。4、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。6、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。提高平端连接效率的方法：1、 低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。2、 在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50100ng。3、 平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。4、 尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。5、 建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。DNA连接试验当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。DNA连接实验原理：分子的体外连接就是在一定条件下， 由连接酶催化两个双链片段组邻的端磷酸与端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， 分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5磷酸和相邻的3羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。 3、 平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。粘性末端连接：实验试剂：用适当的限制酶消化质粒和外源。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。10T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于20。）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇500l/ml BSA（可用可不用）T4DNA连接酶% 5mM ATP实验步骤：1、 在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1) 10l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-15），补足ddH2O 至8l。2) 轻轻混匀，稍加离心，于45水浴分钟使重新退火的粘端解链， 迅速将混合物转入冰浴。3) 加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10l。2、 盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心秒。3、 下过夜连接反应。4、 反应结束后于保存。5、 再设立两个对照反应，其中含有（）只有质粒载体；（）只有外源片段。如果外源量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒，并尽可能多加外源，同时保持连接反应体积不超过10l。可用至少种不同方法来测定噬菌体连接酶的活性。注意事项：1、 连接反应的温度：连接酶的最适反应温度为，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是过夜。2、 DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高的浓度，增加重组子比例。这样就会出现自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。4、 连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。5、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的DNA。若连接成功，则说明有效。平端DNA连接：噬菌体连接酶不同于大肠杆菌连接酶，它可以催化平端片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何分子彼此相连。优点：1、 没有连不上的，只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5或者3突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。2、 有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会。缺点：1、 连接效率比粘性末端低：连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。2、 可能产生双向插入：由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。3、 可能多拷贝插入：平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释。一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。平端连接要求的条件：1、 低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。2、 不存在亚精胺一类的多胺。3、 极高浓度的连接酶（50Weiss单位ml）。4、 高浓度的平端实验试剂：凝聚剂：在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT arrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1、 它们可使平端的连接速率加大个数量级，因此可使连接反应在酶浓度不高的条件下进行2、 它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的浓度下，所有的产物也将是线状多聚体聚乙二醇（PEG8000）：1、 用去离子水配制的8000贮存液（40）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和噬菌体连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20进行温育。2、 连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或gCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。3、 浓度为15的PEG 8000可刺激带粘端的分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。4、 PEG 8000可刺激短至个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。氯化六氨合高钴：1、 氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5mol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。2、 在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状将点尽优势。3、 与 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。实验步骤：(以20ul 酶切完后的体系为例） 1、 如果要补平或切平,先将样品置于70度水浴10min,将体系放大到50ul，其中按照说明书加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等。2、 常温反应10min后将反应物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反应5min。3、 凝胶回收处理的载体或片断。4、 CIAP处理。 5、 苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收。6、 连接反应。注意事项：1、 插入片断和载体片断的比例要高。2、 连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。3、 载体片断要做去磷酸化处理。4、 也可以用15的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。5、 反应体系10UL，不要太大。6、 载体片断不要加多了，一般酶切跑賋并割胶纯化并去磷酸化后加0。5微升就可以了。7、 去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。 8、 插入片断和载体片断要酶切良好。DNA连接实验原理 分子的体外连接就是在一定条件下，由连接酶催化两个双链片段组邻的端磷酸与端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5磷酸和相邻的3羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源D