辣椒内生拮抗菌的分离与鉴定毕业论文

. . 山东农业大学毕 业 论 文题目：辣椒内生拮抗菌的分离与鉴定 学 院 生命科学学院 专业班级 2013级生物工程 4 班 届 次 2017届 学生姓名 罗雪芹 学 号 20137257 指导教师 刘丽英 副教授 二O一七 年 五 月 二十八 日装订线. . 一、指导教师评语根据学生实习及撰写论文情况进行评定： 1、对待实习的态度及实习纪律的遵守情况； 2、能否准确熟练地进行观察记载、搜集整理、查阅资料及运用数据的水平； 3、能否准确熟练地进行各项操作，并运用所学知识解决实际问题； 4、能否很好地完成任务书规定的工作量。 二、评阅教师意见参照以下几方面进行评定： 1、论文选题的实用性、分析的科学性和体系的完整性； 2、获取资料是否丰富，处理资料是否科学、严谨； 3、综合运用基础理论和专业知识的深度、归纳、概括及运算的能力； 4、文字表达能力，文章的逻辑性。 三、论文答辩成绩由答辩小组根据学生语言表达能力及回答问题的准确性进行评定。 四、论文综合评定成绩按优秀、良好、中等、及格和不及格五级计分。 五、毕业论文的成绩评定按照毕业论文评分标准综合评定。 六、论文由学生本人按照毕业论文（设计）规范用计算机排版、打印，一律使用统一封面（A4K）。 七、学生的论文文本（含任务书、图片等）由学院按学校规定存档。 目录中文摘要1英文摘要.11 前言21.1 辣椒主要治病及其防控21.2 内生菌种类及内生细菌的生防作用21.3 植物根组织内生菌的研究意义32 材料与方法42.1 培养基42.2 试剂52.3 实验仪器52.4 样本52.5 试验方法62.5.1 内生细菌的分离62.5.1.1 样本的处理62.5.1.2 内生细菌分离62.5.2 拮抗实验62.5.2.1 接菌培养62.5.2.2 菌丝染色62.5.3 形态观察及革兰氏染色62.5.4 生化实验72.5.5 测序及系统进化树的构建82.5.6 解磷解钾实验82.5.7 十字交叉实验83 结果与分析93.1 内生细菌的分离及拮抗结果93.1.1 内生细菌对病原菌的拮抗效果93.1.2 内生细菌对病原菌菌丝的抑制结果103.2 形态鉴定113.2.1 菌落形态观察113.2.2 菌体形态113.3 生化鉴定结果123.4 16S rDNA鉴定结果133.5 解磷解钾及十字交叉结果144 讨论145 结论15参考文献16致谢18CONTENTSAbstract in Chinese1Abstract in English.11 Introduction21.1 The main treatment of pepper and its prevention and control21.2 Endophytic bacteria and endophytic bacteria biocontrol21.3 Significance of Endophytic Bacteria in Plant Root Tissues32 Materials and methods42.1 Medium42.2 Reagent52.3 Experimental apparatus52.4 Sample52.5 Test method62.5.1 Separation of Endophytic Bacteria62.5.1.1 Handling of samples62.5.1.2 Endogenous bacterial isolation62.5.2 Antagonistic Experiment62.5.2.1 Inoculation culture62.5.2.2 Mycelial staining62.5.3 Morphological observation and Gram stain62.5.4 Biochemical Experiments72.5.5 Equencing and Construction of Phylogenetic Tree82.5.6 Experiment on Dissolving Phosphorus and Potassium82.5.7 Cross Experiment83 Results and Analysis93.1 Endogenous bacterial isolation and antagonism results93.1.1 Antagonistic effect of endophytic bacteria on pathogens93.1.2 Endogenous bacteria on the pathogen mycelium inhibition results103.2 Form identification113.2.1 Observation of colony morphology113.2.2 Cell morphology 113.3 Biochemical identification results123.4 16S rDNA identification results133.5 Dissolved Phosphorus and Potassium Crossing Results144 Discussion 145 Conclusion15Reference16Thanks18山东农业大学学士学位论文辣椒根部内生拮抗菌的分离与鉴定作者：2013级生物工程专业4班 罗雪芹指导老师：刘丽英副教授摘要：炭疽菌、根腐菌等致病真菌是引起辣椒植株患病的主要原因之一，病原菌对辣椒产生的病害使辣椒减产甚至绝收，给农业的收入带来了严重影响。而生物防治是当前的主流，因此筛选出对辣椒致病菌有较好抑制效果的生防菌具有十分重要的意义。本实验从辣椒根部分离筛选出19株内生细菌；然后进行拮抗实验，通过平板对峙筛选出3株对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、链格孢菌、炭疽菌、番茄根腐菌具有较好抑制效果的拮抗菌；再通过形态特征、生理生化指标结合16srDNA序列同源性分析，最终确定LSB-68、XXRB-1为枯草芽孢杆菌，XYRB-11为漠海威芽孢杆菌。此三株菌在生物农药方面具有潜在的应用价值,并可能将在植物病害的生物防治方面发挥重要作用。关键词：生物防治；内生菌；拮抗；鉴定；芽孢杆菌Isolation and Identification of Endophytic Antagonistic Bacteria from Pepper RootAbstract: Pathogenic fungi such as anthrax and root rot fungi are one of the main causes of the disease of pepper plants. The disease caused by chrysanthemum causes the pepper to be cut or even harvested, which has a serious impact on the income of agriculture. And biological control is the current mainstream, so the screening of chili bacteria have a better inhibitory effect of biocontrol has a very important significance. In this experiment, 19 strains of endophytic bacteria were isolated from the roots of pepper. Then, three strains of Fusarium oxysporum fusarium, Fusarium spp. Fusarium, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, The results showed that LSB-68 and XXRB-1 were Bacillus subtilis, and that of XYBB-11 was determined by morphological characteristics, physiological and biochemical indexes and 16s rDNA sequence homology analysis. Bacillus subtilis. The three strains have potential application value in biological pesticides and may play an important role in biological control of plant diseases.Key words: biological control; endophytic bacteria; antagonism; identification; Bacillus11 前言辣椒由于其独特的风味深受人们喜爱，随着农业设施的快速发展，已成为一种四季蔬菜。受其经济效益的促使，种植范围和面积不断扩大，种植密度不断增大，同时，辣椒病害的发生也呈逐年上升趋势。辣椒病害不仅使辣椒减产，严重时可造成辣椒因死棵而绝收，给辣椒生产带来严重的影响，因此正确防控好辣椒病害对提高辣椒的产量和质量有着重要意义1。1.1 辣椒主要治病及其防控炭疽菌、番茄根腐菌、链格孢菌以及多种镰刀菌是常见的植物致病真菌，通常会引起植物患病，导致植株叶片枯萎，长斑，根腐，绝产等，严重影响了辣椒的产量。例如炭疽菌，它通常引起辣椒黑点炭疽病，是辣椒果实的主要病害之一，同时也能引起烂果、枯枝和叶斑等症状，严重影响辣椒品质，造成辣椒减产甚至绝收2。而辣椒根腐病有多种表现症状，但通常病部仅局限于根部和茎基部。植株发育不良，较矮小，后期病株白天萎蔫，傍晚至次日清晨尚可恢复，反复多日后植株枯死，病株茎基部及根部皮层变为褐色至深褐色，呈湿腐状，然后病部缢缩、腐烂，皮层易剥离，露出暗褐色的木质部，最后植株整个根系腐烂，萎蔫死亡1。链格孢菌则能使植株形成大量的坏死型病斑,造成叶枯,提早落叶等症状3，且其分泌的毒素能抑制植物幼苗的生长。镰刀菌不但会造成辣椒等植株根、茎、叶的腐烂萎蔫，引起苗枯、穗腐、植物种子、块茎的腐烂等病害，导致作物严重的减产和损失4；而且产生多种作为此生代谢产物的真菌毒素，能杀死植物细胞核，或者富集在种子里，食用后引起人体器官的衰竭和癌变5。在农业上，辣椒病害对其生产带来了严重的影响，化学防治和生物防治是作物真菌病害的主要防治途径。而传统的农药防治方法不仅效果差、成本高，而且污染环境，相较于化学防治，生物防治作为当前的流行趋势，具有无毒无害、无污染、不产生抗药性和持续高效等优点，符合农业可持续发展的要求，是当前和未来植物病害综合防治的发展方向6。植物病害生物防治主要是利用有利微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治，其核心就是微生物，这些微生物包括细菌、真菌和放线菌等。其中一些微生物存在于植物各组织部位，具有与植物共生，不存在植物间拮抗等优点，成为目前研究的热点，这类微生物即内生菌7。1.2 内生菌种类及内生细菌的生防作用Hallmann (1997) 8 首次完整地将植物内生菌(endophyte)定义为能够在健康植物活组织内生存而不引起明显寄主植物病变的一大类微生物。内生菌的种类十分繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。其中，内生细菌(endophytic bacteria)是内生菌的重要组成部分，目前已从植物根、 茎、叶、花、果实、种子、根瘤等器官中分离出多种内生细菌9-13，一些内生细菌具有促进植物生长14 、固氮15 和 拮抗病原菌16 的作用，在农业生产中具有很大的应用潜力。有研究发现内生细菌在植物不同器官分布数量存在差异，植物根内生细菌数量平均可达105 CFU/g，远远超过茎(104 CFU/g)、叶(103 CFU/g)和其他植物器官8。因此，深入了解植物根组织内生细菌及其在农业上的应用具有重要意义。1.3 植物根组织内生细菌的研究意义人们研究的植物根际内生菌大多是在生防中具有拮抗作用或促生作用的根际内生细菌。这些细菌在寄主植物根内部,具有溶磷、产生植物激素、固氮、合成铁载体、诱导植物产生抗性、产生抗真菌代谢产物等多种生物功能9。因此，本实验对辣椒根部分离出的细菌进行研究，以期获得对辣椒植株具有某些有益作用的细菌菌种，这将对辣椒的增产、生物防治等农业目标带来新的可用资源。2 材料与方法2.1 培养基（1） LB液体培养基蛋白胨，10g；酵母粉，5g；NaCl，10g；水，1000ml。pH 7.2（2）LB平板培养基蛋白胨，10g；酵母粉，5g；NaCl，10g；水，1000ml；琼脂，15-20g。pH 7.2（3） PDA培养基马铃薯，200g；葡萄糖，20g；水，1000ml；琼脂，15-20g。pH 自然（4）高氏号培养基可溶性淀粉，20g；KNO3，1g；NaCl，0.5g；K2HPO4，0.5g；MgSO4，0.5g；FeSO4，0.01g；琼脂，20g；水，1000ml。pH 7.2-7.4（5）淀粉培养基蛋白胨，10g；NaCl，5g；牛肉膏，5g；可溶性淀粉，2g；蒸馏水，1000ml；琼脂，15-20g。pH 自然（6）酪蛋白培养基干酪素，10g；牛肉膏，3g；Na2HPO4，2g；NaCl，5g；蒸馏水，1000ml；琼脂，15g；0.4%溴麝香草酚蓝溶液，12.5ml。pH 7.4（7）明胶培养基牛肉膏蛋白胨液，100ml；明胶，12-18g。pH 7.2-7.4（8）蛋白胨水培养基蛋白胨，10g；NaCl，5g；蒸馏水，1000ml。pH 7.6（9）葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨，5g；葡萄糖，5g；K2HPO4，2g；蒸馏水，1000ml。pH 7.0-7.2（10）糖发酵培养基蛋白胨水培养基，1000ml；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，1-2ml；20%葡萄糖和蔗糖溶液，各10ml。pH 7.6（11）5% NaCl培养基蛋白胨，10g；酵母粉，5g；NaCl，50g；蒸馏水，1000ml。pH 7.2（12）7% NaCl培养基蛋白胨，10g；酵母粉，5g；NaCl，70g；蒸馏水，1000ml。pH 7.2（13）10% NaCl培养基蛋白胨，10g；酵母粉，5g；NaCl，100g；蒸馏水，1000ml。pH 7.2（14）解钾平板培养基钾长石粉，5g；CaSO4.2H2O，0.2g；葡萄糖，10g；Na2HPO4，0.2g；MgSO4.7H2O，0.3g；NaCl，0.3g；CaCO3，5g；琼脂，15-20g；蒸馏水，1000ml。pH 7.2（15）解无机磷平板培养基Ca3(PO4)2，5g；蔗糖，10g；MgSO4.7H2O，0.3g；MnSO4.H2O，0.3g；KCl，0.3g；（NH4）2SO4，0.5g；FeSO4.7H2O，0.03g；NaCl，0.3g；琼脂，15-20g；蒸馏水，1000ml。pH 7.2（16）解有机磷平板培养基卵磷脂，2g；葡萄糖，10g；酵母膏，0.4g；NaCl，0.3g；MnSO4.4H2O，0.03g；CaCO3，5g；（NH4）2SO4，0.5g；KCl，0.3g；FeSO4.7H2O，0.03g；琼脂，15-20g；蒸馏水，1000ml。pH 7.22.2 试剂（1） 卢戈氏碘液先将1g碘化钾溶解在少量水中，再将0.5g碘溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加蒸馏水定容至150ml。（2） 甲基红试剂称取0.04g甲基红溶于60ml的95%乙醇溶液中，然后加入40ml蒸馏水。（3） 吲哚试剂称取2g对二甲基氨基苯甲醛溶于190ml的95%乙醇溶液中，然后加入40ml浓盐酸。（4） V.P.试剂5%-萘酚无水乙醇溶液：称取5g-萘酚溶于100ml无水乙醇溶液中；40%KOH溶液：称取40gKOH溶于适量蒸馏水中，定容至100ml。2.3 实验仪器超净工作台，苏州净化设备有限公司；QL-901 漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；BCD-241WDBB 冰箱，青岛海尔股份有限公司；FA2004 电子天平，上海舜宇恒丰科学仪器有限公司；pHS-3E pH计，上海雷磁仪器厂；UV2800型 紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；GZH-9240MBE 电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂； 生物显微镜2.4 样本供试植株：取自辣椒植株的根系。病原菌：具有普遍致病性的层出镰刀、番茄根腐、腐皮镰刀、植保镰刀、串珠镰刀、链格孢菌、炭疽菌这7种病原菌。2.5 试验方法2.5.1 内生细菌的分离2.5.1.1 样本的处理 称取辣椒根5g，洗净，在超净工作台中用次氯酸钠浸泡10min，然后再用75%的乙醇浸泡1min，之后用无菌水漂洗三次，再将样品根置于研钵中，捣碎，最后加入10ml无菌水，静置2min。2.5.1.2 内生细菌分离 将研磨液吸取100微升，分别涂置LB，涂布3个平板，培养。挑选菌落形态不同的菌种，转接置LB平板上培养24-48h，以供后续实验。2.5.2 拮抗实验2.5.2.1 接菌培养 用枪头先取出一小块病原菌，接种至PDA平板培养基的中间部位，封口膜封口，30，培养3-5天；拿出培养基，划分成4个区域，每个区域的适当位置贴入一张小滤纸片，然后吸取1m细菌菌悬液打在滤纸片上，封口膜封口，30，培养2天。观察拮抗效果。2.5.2.2 菌丝染色将干净的载玻片划分为2个区域，做好标记，然后滴加2滴生理盐水，分别挑取正常生长的病原菌菌丝及拮抗后病原菌与拮抗菌相互作用的病原菌菌丝，涂抹在生理盐水上，自然晾干，然后滴加草酸铵结晶紫染液，覆盖涂菌丝部位，染色1-2min，弃去染液，用清水冲洗，再吸去玻片上的残留液，滴加香柏油，在显微镜下观察拮抗前后菌丝变化。2.5.3 形态观察及革兰氏染色 形态观察：观察转接的LB平板上的菌落，根据菌落形态、颜色、透明度、菌落大小、含水量、粘稠度以及隆起度从中挑选不同的细菌并转接。革兰氏染色观察：清洗1个载玻片，备好生理盐水，酒精灯，接种环，香柏油，载玻片划分为3个区域，在载玻片上做好标记并滴加3滴生理盐水，挑取适量选出的细菌，将接种环置于生理盐水中涂抹均匀，自然风干；然后滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1-2min后倾去染液，水洗至流出水无色；接着用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色；将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色25s，当流出液无色时立即用水洗去乙醇；最后吸去玻片上的残留水，用番红复染色2min，水洗，吸去残水晾干；将载破片置于显微镜载物台上，滴1-2滴香柏油，镜检观察，记录细菌的颜色、形态、有无芽孢、单个细胞的长度和宽度。2.5.4 生化试验以下实验操作中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌做相同的处理，作为对照。（1） 淀粉水解试验 配置淀粉培养基，灭菌，倒板，用记号笔在平板底部划成4部分，做好标记，再用接种环挑取适量菌苔接种至平板上，37，培养24h。然后测定透明圈与菌落的直径，算出比值。（2） 酪蛋白水解试验 配置酪蛋白水解培养基，灭菌，倒板，用记号笔在平板底部划成4部分，做好标记，再用接种环挑取适量菌苔接种至平板上，37，培养24h。然后测定透明圈与菌落的直径，算出比值。（3） 明胶水解试验 配置明胶培养基试管，每管5ml，在试管上做好标记，接种，20，培养2-5天，然后将试管置于-4的冰箱中，放置1小时后，取出观察明胶凝固情况。（4） 接触酶试验 准备干净的载玻片，将玻片划成3个区域，做好标记，用接种环挑取菌苔，涂抹在玻片上，然后往菌苔上滴加1-2滴H2O2，观察反应现象。（5） 糖发酵试验取葡萄糖发酵培养基试管（试管内含有倒置的杜氏小管），每管5ml，做好标记，将细菌接种到培养基中，37%，培养24-48h；用相同的方法进行蔗糖发酵试验。最后观察各试管颜色变化及杜氏小管中有无气泡。（6） 吲哚试验 配置 蛋白胨水培养基，做好标记，接种后置于37，培养48h，然后向培养基中加入3-4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。（7） 甲基红试验 配置 葡萄糖蛋白胨水培养基，做好标记，接种后置于37，培养48h，然后向培养基中加入甲基红试剂2滴。观察结果，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。（8） V-P试验 配置 葡萄糖蛋白胨水培养基，做好标记，接种后置于37，培养48h，然后向培养基中加入5-10滴40%KOH，再加入等量的5%-萘酚溶液，用力震荡，接着放入37温箱中保温15-30min。观察结果，培养物变为红色者为阳性。（9） 耐盐试验分别制备浓度为5%、7%、10%的NaCl试管培养基，每管5ml，其中每种浓度的培养基留出两支不接菌，作为空白对照，做好标记，接菌，37，培养24h。观察培养基的浑浊度。2.5.5 测序及系统进化树的构建首先提取LSB-68、XYRB-11、XXRB-1这3株菌的基因组DNA，经PCR扩增后，测定其16SrDNA序列，将测序结果与NCBI上已知菌种的16SrDNA序列进行BLAST对比。根据16S rDNA 测序结果, 结合NCBI中芽孢杆菌属(Bacillus)中 12 个种 16S rDNA 序列, 利用 MEGA 5.0 软件, 绘制系统发育树。细菌总DNA的提取、16S rDNA的PCR扩增以及测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。2.5.6 解磷解钾实验 用记号笔将平板划分为4个区域，做好标记，然后将筛选出的菌种点接至解钾平板培养基、解有机磷培养基及解无机磷培养基上，37，培养5天，观察有无透明圈。2.5.7 十字交叉实验 用记号笔将平板划分为4个区域，做好标记，用接种环接种，每种菌两两交叉，画十字，37，培养24h，观察菌株之间的相互作用。3 结果与分析3.1 内生细菌的分离及拮抗结果3.1.1 内生细菌对病原菌的拮抗效果总共分离出19株细菌对病原菌有拮抗效果，其中筛选出3株对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、链格孢菌、炭疽菌、番茄根腐菌7种病原菌有较好拮抗效果的菌种。如表1所示，LSB-68对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、链格孢菌、炭疽菌、番茄根腐菌5种病原菌有明显的抑制带；XYRB-11对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、链格孢菌3种病原菌有明显的抑制带；XXRB-1则对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、层出镰刀菌、链格孢菌、番茄根腐菌5病原菌有明显的抑制带。如图1、2、3所示，3株拮抗菌均对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、链格孢菌三种病原菌有较好的拮抗作用，3株拮抗菌对其余的病原菌也具有抑制作用，但效果次之。因此这3株菌种对病原菌具有广谱拮抗性。表1 拮抗结果统计Table1 The statistics of antagonism病原菌LSB-68XYRB-11XXRB-1腐皮镰刀菌+植保镰刀菌+层出镰刀菌+串珠镰刀菌+链格孢菌+炭疽菌+番茄根腐菌+ 注：“+”表示抑制作用很好，“+”表示抑制作用好。 图1 链格孢菌拮抗图Fig.1 The antagonism of the Alternaria alternate 图2 腐皮镰刀菌拮抗图Fig.2 The antagonism of the Fusarium solani 图3 植保镰刀菌拮抗图Fig.3 The antagonism of the Fusarium oxysporum3.1.2 内生细菌对病原菌菌丝的抑制结果 内生细菌对病原菌菌丝的抑制结果如图4、5所示，内生菌LSB-6对炭疽菌有明显的抑制作用，从镜检结果可见，炭疽菌的菌丝比正常菌丝分支增多，菌丝出现膨大，断裂，畸形（图4）；内生菌XYRB-11对腐皮镰刀菌的抑制效果也比较明显，病原菌正常菌丝生长旺盛，粗细均匀，少分支，被抑制后的菌丝比正常菌丝分支多，菌丝出现膨大畸形的现象，病原菌孢子数量也减少了（图5）。内生菌对病原菌的抑制效果与姜华，万科等人的报道相一致，说明筛选出的内生细菌的确对病原菌的生长存在抑制作用17-20。 图4 LSB-68对炭疽菌菌丝的作用Fig.4 The effect of LSB-68 on the mycelium of anthrax 图5 XYRB-11对腐皮镰刀菌菌丝的作用Fig.5 The effect of XYRB-11 on the mycelium of Fusarium solani3.2 形态鉴定3.2.1 菌落形态观察 LSB-68和XYRB-11菌落呈白色，表面干燥，有褶皱，边缘不整齐，不透明且不易挑取；XXRB-1菌株的菌落正反面颜色不一致，正面白色，反面带红，不透明，干燥多褶皱，不易挑取，边缘不整齐。3.2.2 菌体形态表2 革兰氏染色镜检结果Table2 Grams stain test results菌株颜色革兰氏阳性或阴性形态LSB-68紫色阳性杆状，长约2m，有芽孢XYRB-11紫色阳性杆状，长约2m，有芽孢XXRB-1紫色阳性杆状，长3-5m，有芽孢 图6 LSB-68、XYRB-11、XXRB-1镜检图Fig.6 LSB-68、XYRB-11、XXRB-1 microscope image3.3 生化鉴定结果参照常见细菌系统鉴定手册21中相关菌落、菌体形态及革兰氏染色镜检结果初步鉴定得LSB-68、XYRB-11、XXRB-1三者为芽孢杆菌属。进一步根据生化鉴定结果，对照芽孢杆菌属种间鉴别特征表格，鉴定得LSB-68、XYRB-11、XXRB-1均为枯草芽孢杆菌。生化结果如下表3所示，菌株LSB-68和XYRB-11的结果基本相同，XXRB-1结果与两者相比稍有偏差，可能是被实验操作误差影响。表3 生化鉴定结果Table3 Biochemical identification实验项目LSB-68XYRB-11XXRB-1接触酶+-明胶液化实验-糖酵解（Glu）+糖酵解（蔗糖）+吲哚实验+-甲基红实验+V-P实验-解淀粉实验6.114.004.40酪蛋白水解实验1.202.291.505% NaCl+7% NaCl+10% NaCl+注：试验结果“+”表示阳性，其中“+”表示反应结果一般，“+”表示反应结果明显或剧烈；“-”则表示阴性。 图7-8 解淀粉及葡萄糖发酵图 Fig.7-8 The pictures of starch dissolved and glucosefermentation 3.4 16S rDNA鉴定结果 如图9所示，菌株LSB-68和XXRB-1与Bacillus subtilis DSM10 (AJ276351.1)同源性达到83%，遗传距离最小，亲缘关系最近，因此判断这两株菌为枯草芽孢杆菌。图10中，菌株XYRB-11与Bacillus mojavensis ATCC 51516 (AB021191.1)的同源性达到70%，遗传距离最小，亲缘关系最近，因此判断此菌株为漠海威芽孢杆菌。综合生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，确定菌株LSB-68、XXRB-1为枯草芽孢杆菌，菌株XYRB-11为漠海威芽孢杆菌。图9 菌株LSB-68、XXRB-1的系统进化分析 Fig.9 Phylogenetic analysis of strain LSB-68 and XXRB-1图10 菌株XYRB-11的系统进化分析Fig.10 Phylogenetic analysis of strain XYRB-113.5 解磷解钾及十字交叉结果解磷解钾结果中3株内生细菌的菌苔周围没有透明圈的出现，说明3株菌的解磷解钾能力可能不理想，要得到准确的结论，还需进一步检测。如图11所示，十字交叉结果中，3种内生菌两两之间没有抑制作用，可以共同生存。若进行盆栽试验或大田试验，这3株菌的发酵液则可以混合浇灌植株，一起作用于植株而不会产生不利影响。图11 十字交叉图Fig.11 The picture of cross4 讨论 实验筛选出3株细菌LSB-68、XYRB-11和XXRB-1均为芽孢杆菌。据了解，芽孢杆菌是玉米、辣椒、番茄等植株根部常见的内生菌。芽孢杆菌属，是一类革兰氏阳性，需氧或兼性厌氧，产生芽孢，大多数无荚膜，以周生鞭毛运动的细菌。由于芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境如高温、极酸、极盐，而且对各种杀菌剂具有抵抗力，因此，他们在各种自然环境中都能被分离到。另外一些芽孢杆菌菌体生长过程中能产生菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对植物致病菌有明显的抑制作用。在田间实验中，这些菌作为生防菌能有效降低辣椒、玉米等农作物患病的几率，进而避免因作物患病带来的经济损失22，23。因此我认为此类菌在生物防治方面具有潜在的应用价值，对其进行深入研究可能将在植物病害的生物防治方面发挥重要作用。5 结论本实验最终筛选出3株细菌-LSB-68、XYRB-11和XXRB-1。拮抗实验中，这三株细菌对病原菌有广谱拮抗性，它们对病原菌的生长抑制效果明显。解磷解钾实验中，测得3株菌均无解磷解钾能力，说明它们在促进植株吸收钾、磷元素方面不发挥作用。通过生理生化以及16S rDNA 序列分析结果，确定LSB-68和XXRB-1为枯草芽孢杆菌，XYRB-11为漠海威芽孢杆菌。但这三株菌还未进行盆栽试验及大田试验，也未进行安全性检测，因此还不能投入使用。本实验筛选的菌株均为内生细菌，已发表的文献中多涉及内生菌的促生效果，但目前筛选出的8株菌还未进行促生试验，因此有待进一步研究。21参考文献1 童伴玲, 江滔, 赵宇,等. 辣椒根系病害发生特征与防控方法J. 吉林农业, 2016(7):90-90.2 杨青, 易图永. 辣椒炭疽病及其防治研究进展J. 江西农业学报, 2009, 21(7):107-109.3 徐素琴. 链格孢菌引起的林木病害及防治措施J. 林业科技, 1986(5).4 林镇跃, 阙友雄, 刘平武,等. 植物致病镰刀菌的研究进展J. 中国糖料, 2014(1):58-64.5 Rocha L D O, Reis G M, Silva V N D, et al. Molecular characterization and fumonisin production by Fusarium verticillioides, isolated from corn grains of different geographic origins in BrazilJ. International Journal of Food Microbiology, 2011, 145(1):9-21.6 喇文军, 贾书娟, 吴小丽,等. 抑制辣椒炭疽菌的生防芽孢杆菌菌株筛选和鉴定J. 深圳职业技术学院学报, 2016, 15(3):48-52.7 邱德文. 我国植物病害生物防治的现状及发展策略J. 植物保护, 2010, 36(4):15-18.8 Hallmann J, Quadt- Hallmann A, Mahaffee W F, et al. Bacterial endophytes in agricultural cropsJ.Canadian Journal of Microbiology,1997,43(10):895-914.9 喻江, 于镇华, 刘晓冰,等. 植物根组织内生细菌多样性及其促生作用J. 中国农学通报, 2015, 31(13