显微镜操作技术.doc

显微操作技术显微镜的构造与类型我们学习了显微镜的初步的操作技术，了解了显微镜的构造与类型，规范操作技术以及最后显微镜的应用。我们得知普通生物显微镜由3部分构成：照明系统，光学放大系统和机械装置。照明系统，包括光源和聚光器；光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；机械装置，用于固定材料和观察方便 。这是普通显微镜，还有倒置显微镜，荧光显微镜等。1.倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样， 所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。前者置于载物台之下， 而后者在载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高， 可以放置培养皿、培养瓶等容器， 直接对培养的细胞进行照明和观察。2.荧光显微镜以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。3.相差显微镜其研究对象是：用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本。原理是因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(相位差)，这种相位差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。它与其他显微镜主要区别是:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。4.暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。其目的是观察物体的轮廓和分辨不清内部的微细构造， 适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。5.偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。它的不同之处在于：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。 6.激光共聚焦扫描显微镜，它用激光作为扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以它有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 7.电子显微镜。1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska发明了第一台电子显微镜。它的特点是光源与分辨率的关系同样适于电子束， 由于电子束的波长比光的波长短100,000倍， 因而用电子束代替光波，可大大提高显微镜的分辨率。在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构(submicroscope structure)， 或超微结构(ultrastructure)。8.透射电子显微镜：主要是让电子束穿透样片而成像。电子显微镜基本结构由三大部分组成电子光学系统(镜筒)、真空系统、电子学系统(供电系统)。电子光学系统由照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成。由于电子显微镜必需在高度真空条件下进行工作，阴极与阳极之间会放电， 灯丝也会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿命，所以设计了真空系统。电子学系统即供电系统，需要高压稳压。9.扫描电子显微镜：其使用与透射电子显微镜完全不同的方式成像， 即用电视的方式成像。扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元组成。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 10.扫描隧道显微镜由IBM公司瑞士苏黎世研究所的两位学者Binning G.和Rohrer H.等在1981年发明的具有原子显像力的显微镜。根据量子力学中的隧道效应原理而制成的。这种显微镜对生物、物理、化学等学科均有推动作用，可用于研究表面的原子结构和电子结构，故于1986年获得了诺贝尔物理学奖。显微镜使用注意事项：1、使用前先检查显微镜各部件是否完整，如有问题及时报告。2、显微镜位置固定后请不要在操作台面上来回移动。3、显微镜使用之前应由指导老师将显微镜的位限调好，以免观察时压坏玻片损坏显微镜。4、显微镜所有镜片的清洁用专门的擦镜纸擦拭，观察过程中请不要触摸镜片。5、使用显微镜时不可随意拆卸显微镜的任何部分。6、不使用油镜不允许将油镜对到光路上。7、显微镜的使用应有详细的使用记录。 其中石蜡切片法比较常见取材应根据要求选取材料来源及部位。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。固定用适当的化学药液固定液浸渍切成小块的新鲜材料，固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。 脱水酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30或50酒精开始，经70、85、95直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。透明用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍12小时，再转入纯透明剂中浸渍。包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍12小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中，待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片厚度为47微米染色染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。 封固包括切片脱水、透明和封片 染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95