DNA测序 化学降解法.ppt

DNA序列测定 脱氧核糖 含氮碱基 磷酸 A G C T DNA的基本单位 脱氧核苷酸 腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 DNA测序 测定未知序列确定重组DNA的方向与结构对突变进行定位和鉴定比较研究 成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期 1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法 同一时期 Sanger发明了双脱氧链终止法 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代 这些技术统称为第一代DNA测序技术 第二代测序技术 三种第二代测序技术对比 第三代测序技术 第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增 而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系 另外 第二代测序的读长普遍偏短 在进行数据拼接时会遇到麻烦 为了克服这样的缺点 业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术 Maxam GilbertDNA化学降解法 基本原理 直接或间接特异性识别4种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处 5 或3 打断磷酸二酯键 将一个DNA片段的5 端磷酸基作放射性标记 再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基 从而产生一系列长度不一而5 端被标记的DNA片段 这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离 再经放射线自显影 确定各片段末端碱基 从而得出目的DNA的碱基序列 操作步骤 将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记 以便显示DNA条带 分别用不同方法处理 获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳 读取DNA的核苷酸顺序 先用限制性内切酶把DNA切成10 200bp的测序材料 用碱性磷酸化酶处理该片段 消除5 末端上的磷酸 在5 OH端标记32P 用多核苷酸磷酸激酶催化 标记片段变性为单链 用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰 然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链 紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段 产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段 经电泳和放射性自显影后 从4个反应系统统一阅读 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出 该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中 只有1 2种发生特异性的化学切割反应 碱基的特异性修饰 修饰的碱基从核糖环上转移 失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂 专门用来对核苷酸作化学修饰 并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯 dimethylsulphate 和肼 hydrazine 哌啶甲酸等 肼 又称联氨NH2 NH2在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂 如果加入高浓度的盐 1 5MNaCl 肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂 在高温强碱作用 90 1 2MNaOH 下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应 但对胞嘧啶C的反应较弱 哌啶甲酸 90 1mol L 在修饰位点两端使DNA的糖 磷酸链断裂 胞嘧啶 胸腺嘧啶 硫酸二甲酯 dimethylsulphate DMS CH3O 2SO2 一种碱性化学试剂 可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N 甲基化 但是鸟嘌呤G的N 甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4 10倍 并且在中性pH环境中 DMS主要作用于鸟嘌呤G 使之甲基化 导致糖苷键断裂 热哌啶 使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解 导致DNA链在脱嘌呤位点 G和A 发生断裂 DNA化学降解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼 加盐 胞嘧啶开环六氢吡啶C DMS 硫酸二甲酯 在中性pH环境 主要作用于G 被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂 甲酸具有脱嘌呤作用 DNA链在脱嘌呤位点 G和A 发生断裂 肼 在碱性条件下 作用于T胸腺嘧啶和C胞嘧啶 在具有六氢吡啶的条件下 导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂 如果在反应体系中加入高浓度的盐 同胸腺嘧啶的反应速率便会下降 主要作用于C胞嘧啶 A C肼90 C NaOH 1 2M 断裂反应 在4种反应体系中 化学试剂特异地断裂DNA的机制是 G A反应 哌啶 甲酸使嘌呤环上氮原子质子化 削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键 然后哌啶置换了嘌呤 G反应 硫酸二甲酯 DMS 使GN7甲基化 其后断开了C8 C9间的化学键 哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合 T C反应 肼断开了嘧啶环 产生碱基片段被哌啶置换 C反应 在NaCl存在时 只有C才能与肼发生反应 随后 被修饰的胞嘧啶被哌啶置换 在4种反应体系中 化学试剂特异地断裂DNA的机制是 G A反应 哌啶 甲酸使嘌呤环上氮原子质子化 削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键 然后哌啶置换了嘌呤 G反应 硫酸二甲酯 DMS 使GN7甲基化 其后断开了C8 C9间的化学键 哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合 T C反应 肼断开了嘧啶环 产生碱基片段被哌啶置换 C反应 在NaCl存在时 只有C才能与肼发生反应 随后 被修饰的胞嘧啶被哌啶置换 哌啶 5 GATCACTACTG 3 标记 5 GATCACTACTG 3 G DMS C 肼 加盐 G A 甲酸 C T 肼 5 GATCACTACTG 5 G G 5 GATCACTACTG 5 GATCACTA 5 GATCA 5 GA 5 G 5 GATCACTAC 5 GATCACT 5 GATCAC 5 GATC 5 GAT 5 GATCACTACT 5 GATCACTACTG 5 GATCACTAC 5 GATCAC 5 GATC GATCACTACTG 在化学修饰反应过程中 通过控制反应温度和反应时间 只有一小部分碱基被修饰 而不是全部被修饰 随后进行的断裂反应也是定量反应 因此 DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂 而是随机断裂 在4个反应中 产生4套带相同标记末端 长短不一的寡聚核苷酸片段 只有带标记末端的片段可被识别 没有标记末端的片段可以忽略不计 在化学修饰反应过程中 通过控制反应温度和反应时间 只有一小部分碱基被修饰 而不是全部被修饰 随后进行的断裂反应也是定量反应 因此 DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂 而是随机断裂 在4个反应中 产生4套带相同标记末端 长短不一的寡聚核苷酸片段 只有带标记末端的片段可被识别 没有标记末端的片段可以忽略不计 电泳和读谱 具体的测定过程中 首先将3 端或5 端的双链DNA溶解在总体积为50 L的 分别含有0 03mol LNaOH 10 甘油 1mmol LEDTA 0 05 二甲苯蓝和0 05 溴甲酚蓝的溶液中 使双链DNA变性 然后加到由5 10 的丙烯酰胺 0 16 0 33 的双丙烯酰胺 50mmol LTris 硼酸 pH8 3的1mmol LEDTA组成的凝胶板上 进行电泳和放射性自显影等处理 制得一端带标记的单链DNA 电泳检测 310 步骤 毛细管灌胶 步骤 样品盘移动 步骤 电进样及电泳 步骤 荧光激发及检测 化学法读序的方法 化学法测序放射自显影图谱的识读 比较复杂一些 这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的 每组测序图谱为4或5条垂直的阶梯带 A C反应可以不做 该片从胶底部一个个向顶部读 G A和C T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段 如果G A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带 若有即为G碱基 无则为A碱基 同理 C T中则检查C列中有无同样大小条带 有即为C 无则为T 在做了A C反应时 出现较深的带时 可以帮助确定为A碱基 化学法必须4或5个反应管统一阅读 DNA中4个碱基每个位置都有1个相应的片段 待测的DNA全部序列可直接读出 化学法测序采用32P标记DNA进行 条带会较末端法更模糊 更宽 由于分辨率不足 从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200 300bp以内 聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开 根据放射自显影显示区带 直接读出DNA的核苷酸序列 如果G A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带 若有即为G碱基 无则为A碱基 同理 C T中则检查C列中有无同样大小条带 有即为C 无则为T 在做了A C反应时 出现较深的带时 可以帮助确定为A碱基 DNA序列测定的应用 1 测序 PCR克隆测序验证 突变体检测 新基因测序 全基因组测序 系统发育及物种鉴定 2 片段分离 个体识别 亲缘鉴定 SNP关联分析 疾病诊断等 Maxam Gilbert化学降解法的测序长度约250bp 优点 不需要进行酶催化反应 因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差 对未经克隆的DNA片段可以直接测序 化学降解测序法特别适用于测定含有如5 甲基腺嘌呤A或者G C含量较高的DNA片段 以及短链的寡核