总--发酵工程实验课件.ppt

实验一双酶法制备淀粉糖 一 实验目的 1 了解淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆的基本原理 2 掌握淀粉双酶法制备淀粉糖浆的实验方法 以及酶的使用 淀粉的组成 由D 葡萄糖单体组成的同聚物 包括直链淀粉 1 4 糖苷键 和支链淀粉两种类型 1 4 糖苷键 1 6 糖苷键 淀粉颗粒 麦芽 辅料中的淀粉 一般由细胞壁包围 以颗粒状存在 这种颗粒不溶于水 也不受淀粉酶的作用 糖化中的淀粉分解 淀粉的糊化 液化 糖化 糊化是指淀粉在热水中能吸收水分而膨胀 最后淀粉粒破裂 淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊 这一过程称为糊化 简而言之 糊化就是淀粉颗粒在热溶液中膨胀破裂的过程 液化是指利用液化酶将糊化淀粉水解成糊精和低聚糖小分子等 使粘度降低 流动性增高 糖化是指利用利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解 转变为葡萄糖的过程 在生产上称为 糖化 DE值 DE值即葡萄糖值 用以表示淀粉水解程度及糖化程度 指的是葡萄糖占干物质的百分率 即 二 实验原理 淀粉的糖化 许多微生物不能直接利用淀粉 除分泌胞外淀粉酶微生物外 淀粉水解葡萄糖 才能被酵母菌利用 酸解法酶解法酸酶 或酶酸 结合法 酸酶法酶酸法 淀粉糖化的方法 1 酸解法淀粉酸高温高压葡萄糖2 酶解法 双酶法 淀粉a 淀粉酶糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖 液化 糖化 3 酸酶法淀粉酸解法糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖4 酶酸法淀粉a 淀粉酶糊精和低聚糖酸解法葡萄糖 双酶法制备淀粉糖 酶法糖化投资少 工艺稳定 对设备要求也不高 产品质量好 消耗小 收率高 条件温和 对环境影响小 三 试验材料 玉米淀粉 液化型 淀粉酶 酶活力6000单位 g 糖化酶 葡萄糖淀粉酶 酶活力为4 5万单位 g 10 NaOH 5 Na2CO3 5 CaCl2 500ml烧杯 pH试纸 秒表 玻璃棒 恒温水浴锅 电炉 石棉网 温度计 恒温水浴 手持糖度仪 可溶性固形物 四 方法和步骤 1 双酶法生产淀粉糖浆工艺流程100g淀粉 加水200ml 搅拌均匀 淀粉浆 5 碳酸钠调节pH 6 2 6 3 2ml5 CaCl2溶液 90 95 水浴上加热 不断搅拌 淀粉糊化 加入液化型 淀粉酶60mg 不断搅拌 液化 70 80 搅拌20分钟 取样分析DE值 至电炉 隔石棉网 加热到95 至沸 灭活10分钟 过滤 滤液冷却至55 加入糖化酶200mg 调节pH 4 5 于60 65 恒温水浴中糖化3 4小时 3小时取样分析控制DE 42 即为淀粉糖浆 2 检测用手持糖度计测定 直接读取固形物含量 3 糖化过程中DE值的变化 实验二 面包酵母活化和种子液培养 试验材料 面包酵母 葡萄糖 酵母浸膏 牛肉膏 氯化钠 试管 10 150mm 培养皿 烧杯 500mL 锥形瓶 300mL 接种环 酒精灯 牛皮纸 pH试纸 恒温摇床 培养箱 离心机 生物安全柜 血球计数板 光学显微镜 盖玻片 配制培养基 1 制备平板分离培养基 葡萄糖20g 蛋白胨20g 酵母抽提物10g 琼脂20g 水1000mL 灭菌115 20min 每三角瓶分装100mL 灭菌后倒平板 2 制备斜面保藏培养基 葡萄糖20g 蛋白胨20g 酵母抽提物10g 琼脂20g 水1000mL 灭菌115 20min 每试管分装5mL 灭菌后摆斜面待用 3 制备种子培养基 葡萄糖20g 蛋白胨20g 酵母抽提物10g 水1000mL 灭菌115 20min 每三角瓶分装30mL 灭菌待用 1 称量按照培养基配方 准确称量各成份放于瓷缸中 配方 牛肉膏5 0g 蛋白胨10 0g NaCl5 0g 琼脂20 0g 蒸馏水1000ml pH7 0 培养基的配制 培养基的制备过程称量 溶解 调节pH值 过滤 分装及包扎 灭菌 灭菌后试管摆放斜面 2 溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量 搅拌 加热使其溶解 如是配制固体培养基 在琼脂的熔化过程中 需不断搅拌 并控制火力不要使培养基溢出或烧焦 待完全熔化后 补足所失水分 3 调节pH值用玻璃棒沾少许液体 测量PH值 用氢氧化钠和盐酸调节PH 4 过滤用滤纸或多层纱布过滤 一般无特殊要求可省去 5 分装及包扎根据不同的需要 可将制好的培养基分装入试管内 用分装漏斗 或三角瓶内 管 瓶 口塞上棉塞 最后用牛皮纸将棉塞部分包好 6 灭菌 高压蒸汽灭菌 1210C灭菌20分钟 7 灭菌后试管摆放斜面 注意事项 1 称取药品时严防药品混杂 一把牛角匙称一种药品 2 蛋白胨极易吸湿 称取时动作要迅速 2 配制固体培养基时 先将其他药品加热溶解到快沸时 再将称好的琼脂加入 继续加热至琼脂完全熔化 此过程要不断搅拌 以免琼脂糊底 并控制火力 防止沸腾外溢 4 分装量根据试管大小和实际需要而定 固体培养基装量约为管高的1 5 液体培养基的装量约为管高的1 4 三角瓶的装量不超过瓶体的1 2 5 分装过程中注意不要将培养基沾在管 瓶 口上 以免沾污棉塞而引起污染 返回 2 平板分离称取0 1g即发性干酵母 转移至无菌水试管 振荡5min 制成菌悬液 划平板 30 培养2d 用接种环沾取单菌落 划斜面 30 培养30h 3 种子培养无菌条件下 用接种环挑取斜面上菌落 接种至种子培养基 30 150r min 培养30h 血球计数板测种子培养液中酵母菌体密度 三 平板划线分离法 交叉划线法连续划线法 一 实验目的 二 实验原理 三 实验器材 四 实验方法 五 实验作业 微生物数量的测定 实验二 一 实验目的 1 了解显微镜计数的原理 2 学习并掌握使用血球计数板进行微生物直接计数的方法 二 实验原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数 是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法 此法的优点是直观 快速 不论微生物的生理状况如何 都可以在显微镜下一一计数 由于此法得到的是活菌和死菌的总和 故又称为总菌计数法 血球计数板是一块特制的载玻片 其上四条纵槽构成了三个平台 中间的平台又被一短横槽隔成两半 每一边的平台上各刻有一个方格网 每个方格网共分成9个大方格 中央的大方格为计数室 计数室边长1mm 共有400个小方格 加盖玻片于突起部分上时 即形成一个体积为0 1mm3的计数室 即1mm 1mm 0 1mm方格的计数板 在血球计数板上 刻有一些符号和数字 见图一 其含义是 XB K 25为计数板的型号和规格 表示此计数板分25个中格 0 1mm为盖上盖玻片后计数室的高 1 400mm2表示计数室面积是1mm2 分400个小格 每小格面积是1 400mm2 计数室通常也有两种规格 一种是16 25型 即大方格内分为16中格 每一中格又分为25小格 另一种是25 16型 即大方格内分为25中格 每一中格又分为16小格 但是不管计数室是哪一种构造 它们都有一个共同的特点 即每一大方格都是由16 25 25 16 400个小方格组成 1 16 25型的计数板含16中格 每中格有25个小格 一般取四角 1 4 13 16四个中方格 含100个小方格 计数计数重复3次 取其平均值 1ml菌液中的总菌数 100个小方格细胞总数A 100 400 10 1000 稀释倍数B 或计数总数A 4 16 10 1000 稀释倍数B 即计数总数A 4 10000 稀释倍数B2 25 16型的计数板含25中格 每中格有16个小格 一般计数四个角和中央 1 5 13 21 25 的五个中方格 含80个小方格 的细胞数 计数重复3次 取其平均值 1ml菌液中的总菌数 80个小方格细胞总数A 80 400 10 1000 稀释倍数B 或计数总数A 5 25 10 1000 稀释倍数B 即计数总数A 5 10000 稀释倍数B 三 实验器材 1 菌种酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae 菌悬液2 器具显微镜 血球计数板 酒精灯 接种环 无菌水 吸管 盖玻片 计数器 四 实验方法 1 稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释 菌液如不浓 可不必稀释 2 镜检计数室在加样前 先对计数板的计数室进行镜检 若有污物 则需清洗后才能进行计数 3 加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片 再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴 不宜过多 让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室 一般计数室均能充满菌液 注意不可有气泡产生 4 显微镜计数静置几分钟 将计数板放在显微镜下 先用低倍镜找到计数室 再换成高倍镜进行计数 一般以每小格5 10个菌体为宜 每个计数室选右上右下 左上左下和中间的五个中方格中的菌体进行计数 每个样品重复计数两次5 清洗血球计数板计数完毕 将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干或用吹风机吹干 镜检观察每小格内无残留物为止 注意事项1 每天同一时间 各组取出本组的试管 用血球计数板计数酵母菌个数 并作记录 连续观察7天 2 从试管中吸出培养液进行计数之前 要将试管轻轻震荡几下 这样使酵母菌分布均匀 防止酵母凝聚沉淀 提高计数的代表性和准确性 求得的培养液中的酵母菌数量误差小 1 加样时先摇匀菌液 计数室中不可有气泡产生 3 如遇酵母出芽 芽体大小达到母细胞的一半时 作为两个菌体计算 4 清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗 5 对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数 一般可采取 数上线不数下线 数左线不数右线 的原则处理 另两边不计数 计数时 如果使用16格 25格规格的计数室 要按对角线位 取左上 右上 左下 右下4个中格 即100个小格 的酵母菌数 如果规格为25格 16格的计数板 除了取其4个对角方位外 还需再数中央的一个中格 即80个小方格 的酵母菌数 6 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算 对每个样品可计数三次 再取其平均值 计数时应不时调节焦距 才能观察到不同深度的菌体 按公式计算每1ml 或10mL 菌液中所含的酵母菌个数 显微直接计数结果 五 作业 思考题 1 用血球计数板计数时 哪些步骤易造成误差 2 血球计数板测定原理是什么 它有那些原理 实验三面包酵母高密度发酵 一 实验目的1 掌握面包酵母的发酵流程 二 实验原理 酵母高密度发酵技术是一种新型的生化工程技术 其产品在化工 食品 环保 医药等方面都存在极大的潜在能力 一般认为发酵液中酵母干重浓度达到30g L以上 即为高密度发酵 三 试验材料 面包酵母 葡萄糖 酵母浸膏 牛肉膏 氯化钠 试管 10 150mm 烧杯 500mL 锥形瓶 300mL 涂布棒 酒精灯 牛皮纸 pH试纸 恒温摇床 培养箱 离心机 生物安全柜 血球计数板 光学显微镜 发酵培养基 酪蛋白胨15g L 酵母粉25g L 葡萄糖30g L KH2PO42 4g L K2HPO4 3H2O16 34g L高密度培养发酵培养基 蔗糖75g L 酵母浸膏33g L 蛋白胨16g L 硫酸镁1 0g L K2HPO4 3H2O3 4g L 甘氨酸2g L最佳培养条件为转