结肠炎模型.doc

结肠炎（UC）模型的建立及药物的治疗测定DSS是一种有蔗糖合成的，有抗止血和抗凝血作用的肝素样硫酸多醣体。BALB/c鼠的遗传背景为近交系，由亲兄弟姐妹遗传繁殖，因而它们之间的个体差异就小，遗传基因更纯，整体素质更好。采用在蒸馏水中加入DSS制成5%DSS溶液给予小鼠自由饮用造模。一、确定DSS的最适浓度实验材料：BALB/c小鼠6只，全是雌性。8-10周左右，体重约为25-30g.实验试剂：葡聚糖硫酸钠（DSS）（MW=40000），配制成4%的浓度溶液。实验仪器：电子天平，生物显微镜，微量移液器，枪头。实验方法：将小鼠随机分为3组，每组2只。分别为 正常对照组，4%DSS浓度组。二实验步骤1. 将6只小鼠正常喂养5天。2. 5天以后，正常对照组继续正常饲养，但4%DSS浓度组分别喂养配置好的4% 溶液10ml。（一日/一次，连续7天，7天内每天同一时间测量小鼠体重，粪便，便血情况，并进行活动指数评分。）建模期间控制小鼠的食量。疾病活动指数（DAI）的评估每日观察小鼠的体重、大便性状和隐血情况，按表1进行评分。将体重下降、大便性状和隐血情况的评分相加，得出每只小鼠的DAI，以评估疾病活动情况。表1 DA I 评分标准体重下降（%）大便形状*大便隐血/肉眼血便计分015610111516正常松散稀便正常隐血阳性肉眼血便01234*正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛门的糊状、半成形大便；稀便：可黏附于肛门的稀水样便。 硫酸甲氨基酚法进行大便隐血试验（试剂:10g/l硫酸甲氨基酚乙酸溶液:称取硫酸甲氨基酚1g，溶于40ml蒸馏水中，加冰乙酸30ml溶解，蒸馏水加至100ml混匀 。放入棕色瓶中避光保存，如有变色则应重新配制。3% 过氧化氢溶液。方法:取少许粪便涂于玻片中央，滴加10g/l硫酸甲氨基酚乙酸溶液3滴，及3% 过氧化氢溶液3滴混匀，立即观察结果。阴性(-):3分钟后不出现玫瑰红色或樱红色;(+):3060秒钟内显玫瑰红色或樱红色;强阳性(+):立即显玫瑰红色或樱红色;最强阳性(+):立即显深玫瑰红色或深樱红色;隐血试验注意事项:1、3%过氧化氢易失效，用前滴加在血膜上，有气泡产生方可应用。2、禁止使用铁、铜、叶绿素剂、碘化钾、溴化物等药物后检验。3、试验用具应加热处理，以破坏污染的过氧化酶。4、标本采集立即送检，并应从便表面与内部挑取两处粪便进行检验。）2. 组织学损伤的的评估实验第8天用浓度1%戊巴比妥50-60mg/kg腹腔注射麻醉，眼球取血，离心，取血清。剖腹，观察结肠外观取肛门至回盲部的结肠，并测量结肠的长度。沿肠系膜边缘纵行剖开，在解剖镜下观察结肠大体形态。每只小鼠于有严重炎症或溃疡处取标本2cm的结肠组织置于10%中福尔马林浸泡固定，24h后常规石腊包埋、切片 (4u m)，HE染色，观察组织学改变并按表2评分。组织学损伤程度用炎症、病变深度、陷窝破坏评分与病变范围评分的乘积表示。表2 组织学损伤评分标准项目计分炎症：无轻度重 度病变深度:无黏膜 下 层肌 层浆膜 层隐窝破坏:无基底 1 /3 隐窝 被 破 坏基底 2 /3 隐窝 被 破 坏仅有 完 整 表 面 上 皮全部 隐 窝 和 上 皮 被 破坏病变范围(/%):1-2526-5051-7576-1000120123012340123二造模实验材料：BALB/c小鼠6只，全是雌性。8-10周左右，体重约为25-30g.实验试剂：葡聚糖硫酸钠（DSS），配制成4 %的浓度（MW=40000）（先做预实验，确定DSS的最佳浓度）实验仪器：电子天平，生物显微镜，微量移液器，枪头。实验方法：1.将小鼠随机分为3组，每组2只。分别为 正常对照组，阴性对照组，药物组。将6只小鼠正常喂养5天。2. 5天以后，正常对照组继续正常饲养，但阴性对照组、药物组分别喂养配置好的 4% DSS溶液7ml（只）。 （一日/一次，连续7天，7天内每天同一时间测量小鼠体重，粪便，便血情况，并进行活动指数评分。）建模期间控制小鼠的食量。3. 第8天每组各取1只，眼球取血，解剖，并观察造模情况。(测量标准同上)同时给阴性对照组和药物组剩下的1只注射药物。（提前计算药物最小致死量）4. 造模成功后次日给药，正常组和阴性对照组:每天灌喂等体积的生理盐水。阳性药物组：美沙拉嗪20mg/kg，隔天腹腔注射给药。药物低、中、高浓度组每天给药，连续给药7天，每天一次（给药方式为灌胃）。各组小鼠给药期间，观察小鼠体重、皮毛色泽、粪便情况。5 末次给药24小时后摘取眼球取血，分离血清，测定血清中MPO（过氧化物酶）和NO（一氧化氮）的活性。并处死小鼠，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，沿肠系膜纵轴剪开，预冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，肉眼观察各组小鼠结肠的大体改变，测量结肠长度及记录湿重。剪取病变最严重的1cm,4%甲醛固定、石蜡包埋、切片。HE染色，观察病