蛋白质重点.doc

一、名词解释1、蛋白质组：由Marc Wilkins在1994年提出，由 protein 与genome复合而成。一种基因组所能表达的全套蛋白质；一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。2、双向凝胶电泳（二维凝胶电泳）：是目前能将数千种蛋白质分子同时分离与展示的唯一的分离技术 （色谱技术不能同时展示在一张图上）。3、色谱质谱技术：弥补以2-DE/MS 为基础的蛋白质组技术方法的不足。4、蛋白质图像分析系统：完成2-DE后，凝胶图像要扫描保存， 以数字化图像的形式储存起来。5、质谱 （MS）：特殊的天平：称量离子的质量，离子源到质量分析器再到检测器最后依据不同方式将样品离子按质荷比 mz分开。6、肽质量指纹谱（PMF)是指蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有特定的质量，且产生的片段数目亦有特异性，故称指纹谱7、多级质量分析器：三级四极杆质量分析器由三个顺序连接的四极杆构成，第一、三分别用于母离子和子离子选择（扫描），第二个用于碰撞解离产生子离子。8、四极滤质器：四极滤质器（四极杆）由四根平行金属杆组成，理想的四杆为双曲线，但常用的是四支圆柱形金属杆，被加速的离子束穿过对准四根极杆之间空间的准直小孔。通过在四极杆上加上直流电压U和射频电压Vcost，在杆间形成一个射频场，离子进入此射频场后，会受到电场力作用，只有合适mz的离子才会通过稳定的振荡进入检测器。只要改变U和V并保持UV比值恒定时，可以实现不同mz的检测。9、肽序列标签技术（PST）：数据库检索鉴定蛋白质时，可用读出的部分氨基酸序列结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查寻，这一鉴定法称为肽序列标签技术。二、填空1、蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）：双向电泳、生物质谱技术、计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。2、ICAT试剂由三部分组成：活性基团、连接子、生物素3、二维色谱有多种组合模式：常用离子交换色谱或凝胶过滤色谱、反相色谱。4、细胞裂解的方法：温和的裂解方法（用于比较简单的样品：组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。）、剧烈的裂解方法（用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。）、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解（细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备）、通过沉淀分离、清除影响二维电泳图谱的杂质5、温和的裂解方法:渗透裂解（低渗溶液悬浮细胞）、冻融裂解（用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min)，随后在37 融化(1-2 min) ，反复几次。）、去污剂裂解（主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲液重悬细胞）、酶裂解法（裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。）6、等渗缓冲液含有某种酶：溶菌酶 细菌；纤维素酶和果胶酶 植物细胞；溶细胞酶 酵母细胞7、剧烈的裂解方法：超声裂解法、弗氏压碎法、研磨法、机械匀浆法、玻璃珠匀浆法8、强变性剂：8 mol/L尿素、10% TCA 或 2% SDS但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。9、沉淀方法：硫酸铵沉淀（盐析）、 TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）、丙酮沉淀、在冰丙酮中用TCA沉淀、苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。10、清除影响二维电泳图谱的杂质一方面沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质11、双向电泳与蛋白质分离是利用了蛋白的两个特性对其进行分离：等点聚焦电泳是利用蛋白的等点电进行分离；SDSPAGE是利用蛋白的相对分子量分离12、修饰基团有20多种类型，常见的有磷酸化、糖基化和乙酰化等。13、糖蛋白分子结构具有不均一性微不均一性（不同的糖链连接与同一位点），糖蛋白的微不均一性，使得分子离子峰变宽，检测灵敏度降低。显著不均一性（同一蛋白质不同的氨基酸位点连接糖）。14、通过沉淀分离蛋白分离策略：沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白质。附带作用：浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。注意：某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。三、简答1、蛋白质组学诞生的背景？答：基因组的局限性；全方位蛋白质研究的迫切要求；医药研究开发的巨大需求 ；高通量分离、鉴定技术的出现；计算机信息科学的有力支持2、蛋白质组学的几个主要研究方向？答：1）针对已有基因组或转录组数据库的物种或组织/细胞，建立蛋白质组或亚蛋白质组（蛋白表达谱）及蛋白质组连锁群 compositional proteomics（完全蛋白质组学：检测一种细胞或一种组织内基因组表达的所有蛋白质 ）。2）以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要的生理/病理体系或过程的比较蛋白质组研究 comparative proteomics（差异蛋白质组学：主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本之间蛋白质组的区别与变化 ）。3）蛋白质组学的技术平台（双向电泳的分辨率、上样量、蛋白鉴定手段、蛋白质之间相互关系作用联系）和蛋白质组信息学的进一步发展。3、蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）：答：1)双向电泳（2-DE），O Farrel 在1975建立，可以分离数千种蛋白质。1980s，固相化pH梯度凝胶，改善了2-D的重复性，增大了上样量。2)生物质谱技术，精确测定生物大分子相对质量及多肽序列。3)计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：定量蛋白质组学中应用的同位素编码亲和序列标签技术 (ICAT)和双色荧光技术；蛋白质间相互作用研究的酵母双杂交技术和蛋白质复合物免疫分离技术 （免疫共沉淀，CoIP）；大规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱与质谱联用技术。用于翻译后修饰（磷酸化，糖基化等）蛋白质图谱展示与检测的技术；蛋白质芯片技术等。4、ICAT试剂由三部分组成：答：活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；连接子，用于结合稳定的同位素；（X代表8个氢或者氘原子）生物素（Biotin），作为亲和标签，能与卵白素结合，用于选择分离标记的多肽。首先，对蛋白质进行标记。接下来，蛋白酶切 形成多肽混合物。然后再使用亲和色谱分离只有标记肽段被保留（先洗脱下未标记肽段，再改变洗脱条件，洗脱下别标记肽段）。这样，使样品变得简单。比较标记了重链和轻链的肽段在质谱图中的信号强度，这样，可以实现对差异蛋白质的定量分析。5、2-DE与2D-HPLC的比较？答：2-DE优点：高分辨率， 1000个蛋白质；可得到 PI、MW 信息；可得到蛋白表达谱；可平行运行多块胶。缺点：费时、费力；不易自动化；碱性、酸性、疏水、 200 kD蛋白易丢失；负载量限制2D-HPLC优点：快速；可分离各种蛋白质；易于自动化；可制备和浓缩样品。缺点：不能得到 PI、MW 信息；尚未实现平行操作；不易得到蛋白表达谱；分辨路不够高6、蛋白质的分步提取技术具体步骤：答：以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。以含Urea/CHAPS/DTT的溶液提取（传统裂解，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。以含硫脲/SB3-10/TBP 的溶液提取（主要溶解疏水性蛋白）。有实验表明，11个大肠杆菌的膜蛋白在第三步提取出来。7、等点聚焦电泳原理：答：构成蛋白质的氨基酸是两性电解质，决定了蛋白质的在一定的pH 条件下带有电荷。在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负。在某一pH条件下，蛋白质所带净电荷为零时；则此pH为该蛋白的等电点 (pI)。蛋白质的等电点取决于蛋白质的氨基酸组成，是蛋白质的一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。据此，设计含有pH梯度的凝胶在外加电场作用下，蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处。8、IPG胶条的平衡：答：在第一向等点聚焦电泳结束之后，第二向电泳进行之前，必须对胶条进行平衡。平衡第一步的作用是让蛋白变性，当SDS单体浓度高于1 mmol/L时，与蛋白定量结合(1g蛋白/1.4g SDS)，掩盖蛋白所带电荷，并使构象均呈 雪茄装。平衡的第二步 是以碘乙酰胺 代替第一步中使用的DTT，否则DTT会影响SDS-PAGE 的电泳效果。9、SDSPAGE原理：答：在电场的作用下，带电粒子能在凝胶中迁移，迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。SDS能与蛋白的结合，改变蛋白原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其直径一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系。10、胶上蛋白检测：答：1）考马斯亮蓝染色 特点：简单、无毒性、对比度好、与下游蛋白鉴定方法兼容。缺点：检出限10 ng、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h）2）银染 特点：灵敏度200 pg。缺点：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定。11、蛋白质图像分析系统工作步骤：答：1）蛋白质点检测 ；2）背景消减 扣除背景染 色对蛋白丰度计算的影响；3）归一化处理使不同胶上同一蛋白质点准确地相对定量，进行比较。基于所有点或某一点（已知蛋白或外源添加的）体积；4）蛋白质点匹配不同胶上同一蛋白质点的位置准确地对应，量（丰度）比较。12、MALDI 离子源原理：答：分析物分散于基质中，形成晶体；激光束辐射到基质和样品分子上；基质吸收激光束能量后汽化，部分样品分子伴随基质的汽化而解吸，基质与样品之间发生电荷转移，样品分子电离特点之一：产生的离子多为单电荷离子 谱峰与样品各组分的质量数又一一对应关系，所以 MALDI 最适宜分析多肽及蛋白混合物。基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：极性化合物 溶解样品；芳环吸收激光；易结晶均匀分散样品分子13、MALDI离子源通常用飞行时间 (time of flight, TOF) 检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS)。原理：答：脉冲激光使样本离子化，在外加电场作用下获得动能，进入高真空无电场飞行管道，以在加速电场内获得的速度飞行。质量较小的离子飞行速度快，到达检测器早；质量较大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。飞行时间检测器的质量分析范围很大，从几百Da到300KDa都可以检测。E = U z = 1/2 mv2 ； t=L/v ； t = const ( m/z )1/2 E: 离子在加速电场获得的动能； U：加速电场电压； z：离子所带电荷数； m: 离子质量；L: 飞行管道长度； t: 离子飞行时间； const: 常数离子飞行时间 t 取决于质荷比的平方根；MALDI 产生的离子多为单电荷离子。t 反映 m14、反射飞行时间质量检测器 (RETOF-MS)答：线形 MALDI-TOF-MS 质量分辨率和测量准确度不高，测量误差 0.2%，不能满足蛋白分析的需要。造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。这样，即使是质量相同的离子，由于产生时间的先后，产生空间的前后和初始动能的大小不同，达到检测器的时间就不相同，因而降低了分辨率。目前，通过采取激光脉冲电离方式，离子延迟引出技术和离子反射技术，可在很大程度上克服上述三个原因造成的分辨率下降。15、肽质量指纹谱特点：答：测定肽混合物质量最有效的仪器是MALDI-TOF-MS，因为谱峰简单、且与肽段一一对应，不需要全部肽段均与理论值相符，能克服蛋白修饰带来的不易检测的问题。16、为什么酶切蛋白样品？答：蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。其它：酶切酶切产生肽段数目固定（指纹谱）；18O从头标记。17、常用酶类要 求：水解为点专一；切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索； 酶自身稳定，不易降解。常用酶类：胰蛋白酶 作用于Lys和Arg的羧基端（当Arg后为Pro 时不能切割 ）；Glu-C蛋白酶 作用于Asp和Glu的羧基端。18、电喷雾电离源原理：答：利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流作用下：液滴溶剂蒸发，表面积减小，表面电荷密度不断增加，库伦斥力与表面张力达到雷利极限液滴爆裂为带电的子液滴；这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离子形式进入质量分析器。19、电喷雾串联质谱 ( LC-ESI-MS/MS )： ESI后连接串联质谱，可检测离子结构碎片和质荷比，提供离子结构（比如序列）的信息，应用于核酸、多肽及蛋白的鉴定和翻译后修饰的分析。20、串联质谱鉴定蛋白质技术原理：肽段母离子在碰撞室经高速惰性气体碰撞解离，在酰胺键处断裂形成子离子。根据断裂处相邻而形成的子离子的质量差，确定氨基酸残基，进而推算出氨基酸序列。注 意：串联质谱不能分辨 Leu和 Ile （同分异构体，残基相对分子量相同）。21、串联质谱产物离子扫描将选定的磷酸肽在CID室打碎，检测其全部碎片离子， 根据碎片离子质量数推断肽段的序列和磷酸化位点。磷酸肽在CID室碰撞诱导解离后，易产生丢失80 Da （HPO3） 和98 Da （H3PO4）的碎片离子，这些离子形成的峰很高，易分辨。22、糖基化蛋白质的鉴定糖基化蛋白简称糖蛋白，广泛存在于动物、植物、微生物和病毒中。糖蛋白在各种生命现象中发挥重要作用：细胞识别、信号转导、免疫与应答、分化与反分化等均与糖蛋白的糖链结构和功能有关。真核细胞表达的糖蛋白药物，如干扰素 （IFN）和促红细胞生成素 （EPO）都需要正确的糖基化修饰。23、正向酵母双杂交原理：酵母双杂交系统主要应用于研究蛋白质之间的相互作用，它的建立得益于对真核生物转录起始过程的认识。酵母的GAL4蛋白是一种典型的转录因子，其DNA结合结构域 (BD) 靠近羧基端，含有几个锌指结构，结合酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)。而GAL4的转录激活结构域 (AD) 可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。单独的BD或AD，都不足以激活转录，两者必须结合才行。二个结构域可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且可重建以发挥转录激活作用。如果X蛋白与BD融合形成“诱饵” （bait）蛋白、Y蛋白与AD融合形成“猎物” （prey）蛋白后，能形成转录激活复合物激活报告基因的表达，就可证明X蛋白和Y蛋白之间存在相互作用。24、免疫共沉淀技术(CoIP)原理：CoIP是检测蛋白与蛋白之间相互作用的体内实验技术。细胞裂解后在非变性条件下制备总蛋白提取物。以一种蛋白的抗体（结合于固相亲和介质）特异地免疫沉淀这种蛋白，然后用第二种蛋白或更多种蛋白的抗体做免疫印迹，检测它们是否被第一种