邝昌慧等论文06-04-02最终稿

华南农业大学大学生科技创新活动项目猪 食 道 口 线 虫 Cold-SSCP鉴 别 方 法 的 建 立邝昌慧 黎晓仪 吕秋凤 林瑞庆 朱兴全 （华南农业大学兽医学院 广州 510642）华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心摘 要食道口线虫病是由食道口科食道口属(Oesophagostomum)的多种线虫寄生于动物肠道引起，严重感染时可引起结肠炎。目前，此病在我国各地牛、羊、猪中普遍存在，给畜牧业生产造成较大经济损失。虽然食道口线虫通常只在反刍动物、猪和猴子上发现，但也有感染人的报道。因此，对食道口线虫的研究，除对畜牧业生产有重要意义外，也具有重要的公共卫生的意义。聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术是一种简便、快速、灵敏的基因突变分析方法，能有效地检出碱基突变。目前，该方法在寄生虫学领域已得到日益广泛和深入的应用，尤其是近几年来用于寄生虫的分子分类学、分子遗传学、虫种及虫株鉴定等方面的研究已取得了很大的成功，但由于同位素的使用所以存在一定的安全性问题，近年来有些研究应用改良的不使用同位素的Cold-SSCP方法并取得成功。以Cold-SSCP对寄生虫进行分类鉴定的可靠性除与所选用的研究方法有关外，也与选取的DNA序列有关，内转录间隔区（ITS）是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区。由于ITS序列在生物进化过程中显示种的特征，种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，许多研究表明ITS序列在寄生虫进化机制和系统重建研究上是一种有效的分子标记。本项研究以PCR的方法扩增采自我国不同地区的猪食道口线虫ITS-2序列片段，然后以Cold-SSCP方法进行分析比较。实验结果显示所有样品分为两种主带型，序列分析证明两种带型的样品分别为有齿食道口线虫和四棘食道口线虫，其中有个别样品的带型存在多态性现象，序列分析表明该样品存在多态性位点。Cold-SSCP方法具有简单，快速，安全等优越性，本研究所建立的Cold-SSCP技术将为食道口线虫的防治及分子生物学等的进一步研究奠定基础。关键词：猪 食道口线虫 ITS-2 PCR Cold-SSCP 序列分析目 录1 前言42 材料与方法42.1 材料42.1.1虫体样品42.1.2引物52.1.3 仪器设备与其他材料52.1.4 0.5TBE电泳缓冲液 52.2 方法62.2.1虫体处理 62.2.2虫体的裂解 62.2.3虫体DNA的抽提和纯化 62.2.4 Cold-SSCP方法的操作83 结果与分析 93.1 猪食道口线虫rDNA ITS-2的PCR扩增 93.2 Cold-SSCP结果 103.3 ITS-2核苷酸序列分析 104 讨论 10致谢12参考文献131 .前言食道口线虫病是由食道口科食道口属(Oesophagostomum)的多种线虫寄生于动物肠道引起，严重感染时可引起结肠炎。目前，此病在我国各地牛、羊、猪中普遍存在，给畜牧业生产造成较大经济损失1-4。虽然食道口线虫通常只在反刍动物、猪和猴子上发现，但也有感染人的报道5。因此，对食道口线虫的研究，除对畜牧业生产有重要意义外，也具有重要的公共卫生的意义。食道口线虫的分类鉴定是从事所有相关研究的基础，国内调查表明，感染猪的食道口线虫主要是有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）和长尾食道口线虫（Oesophagostomum longicaudum）,国外称长尾食道口线虫为四棘食道口线虫（Oesophagostomum quadrispinulatum）6。两种食道口线虫形态相近，形态学方法分类有局限性，特别是对虫卵及幼虫形态学鉴定十分困难。针对这种情况，国外已有应用PCR、PCR连接的限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 分析，PCR连接的单链构象多态性（PCR-SSCP）分析等用于食道口线虫分类鉴定的报道，大大地促进了食道口线虫分类学的研究7-9，在本研究之前，我们已经建立了猪食道口线虫的PCR-SSCP分子鉴定方法10，但是，由于实验使用到同位素，因此具有一定的生物安全性问题，实验者需做充分的防护。鉴于此，本项目对PCR-SSCP方法进行改进，不使用同位素标记，对从国内不同地区猪体分离出来的食道口线虫的ITS-2序列进行PCR扩增，以溴化乙锭染色来观察结果，避免了同位素的使用和X光片显影等繁复步骤，建立Cold-SSCP鉴别鉴定方法，保留了PCR-SSCP方法的简易性、敏感性等优点，又不存在生物安全性问题。本研究在国内外首次建立猪食道口线虫的Cold-SSCP鉴定方法，为猪食道口线虫病的防治等进一步研究奠定基础。2材料与方法2.1 材料2.1.1虫体样品虫体样品来自中国广东阳江、重庆及湖南，宿主为猪，形态学初步鉴定为食道口线虫，PCR-SSCP或测序定种，70%酒精保存（表1）。表1食道口线虫样品编号与来源虫种编号和来源有齿食道口线虫OspYJ6V 阳江OspCQa10重庆OspNX1湖南宁乡OspYY2湖南岳阳四棘食道口线虫OspYJ5V；OspYJ7I 阳江 OspCQa1；OspCQa9重庆2.1.2引物扩增ITS-2的引物为NC2(5TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT3)和根据已测食道口线虫序列以及网上发表的相应序列设计的O5.8sF(5ATTGCAGACGCTTAGAGTGG3)，均由上海英骏生物技术有限公司合成。2.1.3仪器设备与其它材料QL-901 旋涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂。TGL-16B 台式离心机：上海安亭科学仪器厂。WFH-201 型紫外分析仪：广州深华生物技术有限公司。凝胶图象分析系统：英国 UVITEC 公司。恒压恒流 DF-D11 型电泳仪：北京东方特力科贸中心。Bio-RAD 电泳系统：美国 Bio-Rad 公司。Biometra PCR 仪：德国 Biometra 公司。pGEM-T Easy载体试剂盒，感受态细胞JM109，T4 连接酶，为美国Promega产品。Taq DNA聚合酶，DL-2000 DNA Marker，dNTPs为TaKaRa产品。蛋白酶K为美国Merk公司产品。琼脂糖为北京鼎国公司产品。溴化乙锭（E.B），TEMED、氨苄青霉素为Sigma公司产品。MDE(Mutation Detection Enhancement)胶，为美国Biowhittaker Molccular Applications公司产品。2.1.4 0.5 TBE电泳缓冲液准确称取Tris碱5.4克，硼酸2.75克，充分溶解于800ml去离子水中，加10 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，用去离子水定容至1000ml。2.2方法2.2.1虫体处理将浸泡于70酒精的虫体取出置平皿中，用双蒸水反复吹打冲洗23次后，再用超纯水反复冲洗，将单个的虫体置于一新的1.5ml的离心管中，然后将超纯水吸干净。2.2.2 虫体材料的裂解往各个离心管里加入280l的SDS裂解缓冲液消化液，轻轻混匀，加入20l（25g/l）的蛋白酶K，用旋涡震荡器混匀后，37恒温消化1248小时，期间不时摇动离心管，使虫体组织裂解充分。消化液组成见表2：表2 虫体消化液组成组分体积（l）500mM NaCl70100mM Tris-HCl (pH8.0)3050mM EDTA (pH8.0)15010 SDS302.2.3虫体DNA的抽提和纯化按Promega试剂盒WizardDNA Clean-Up System 使用说明对DNA进行纯化。方法如下：（1）取出在恒温箱中作用了约20小时的离心管，旋涡震荡混匀样品，1000 rpm离心2min，上清即为虫体DNA溶液。将上清转移至一新的离心管中，加入1ml清洗树脂（按50500ul悬液/1ml清洗树脂的比例），旋涡震荡混匀。（2）取一支5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上Wizard微型柱。（3）将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，慢慢地将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。（4）将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2ml柱洗溶液（80%的异丙醇），用注射器内芯推液筒慢慢地将柱洗溶液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。（5）拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，100000 rpm 离心20 sec，以除去残留的异丙醇。（6）将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入3050 ul 预热（6070）的超纯水或1TE 缓冲液，静置 1min，100000 rpm 离心20 sec。离心管内的液体即为DNA溶液。可将DNA溶液转移至0.5ml的离心管中于-20保存备用。（7）目的片段的PCR扩增：表3 PCR反应体系组分体积（l）H2O3210 PCR buffer(Mgcl2-free)5.0Mgcl2(25mM)6.0dNTPs(25mM of each)4.0Primer A0.25Primer B0.25Taq Polymerase(5U/l)0.5Total48混匀后分装，每管加2l DNA，快速混匀后，放PCR扩增仪中进行扩增，其条件见表4：表4 PCR反应条件StepTem()Time1945分钟29430秒35530秒47230秒5go to step 2 for another 34 cycles6772165分钟24小时（8）1琼脂糖凝胶电泳观察结果称取2克琼脂糖，加入200ml 0.5 TBE，加热充分沸腾后冷却至50左右，加16l EB，充分摇匀。等到稍微冷却倒入已封好的凝胶灌制胶模中，插上样品梳。待琼脂完全凝固后，小心拔出梳子，再撕掉封带，将凝胶灌制胶模放入电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液。点样：取3l PCR产物与适量的加样缓冲液充分混匀，然后用取液器将样品加入点样孔中，同时设以适宜的DNA分子量标准物（marker）作为参照。电泳：接通电源，使DNA向阳极移动，在110V/cm凝胶的电压下（常用100V）进行电泳。当加样缓冲液的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时（大概15分钟），关闭电源。结果观察：将电泳好的胶置于紫外透射仪中，打开紫外灯，可看到橙红色的核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA对照，通过线性DNA条带的相对位置，可初步估计样品的分子量。如果结果比较满意，则用凝胶成像系统进行摄像，保存图像。2.2.4 Cold-SSCP方法的操作（1）洗板玻璃板先用10M的NaOH处理1224小时，再用稀硫酸（1%）处理3小时，再用水浸泡半天。将处理过的玻板用双蒸水洗3次，每次檫干，然后用95%的酒精洗3次，每次檫干，确保玻板的倒胶面无尘油脂等。在小玻板的胶面涂上一层gelslick（80ul）。将大玻板和小玻板合上，夹在架上备用，下面垫上橡皮。（2）配胶 表6 配胶原料Step配方剂量1双蒸水3.9ml25TBE0.6 ml3MD胶1.5 ml410%过硫酸胺31ul5TMD聚合胶3ul（3）灌胶配胶后混匀，然后用1ml取液器取胶进行灌胶，注意不能有气泡产生，直至灌满，然后插入洁净的梳子，注意垂直插入。（4）凝胶凝胶6080分钟左右就拔去梳子，将胶放入胶架，插入内盒，卡紧，灌入0.5TBE至淹过内侧玻板并观察是否有漏夜，若有渗漏，则要重新卡紧架子，直至不漏（必要时可在边上涂上凡士林）。（5）预电泳每孔加入12ul Stop Solution，然后预电泳10分钟。（6）样品准备将PCR产物按1215ul的量逐个加入离心管中，再加对应每个离心管加57ul的Stop Solution，混合，离心，再94变性5min，-20速冻2min。（7）加样取出速冻的样品，从每个离心管中取出20ul的混合液加进样品孔中，120V电泳4小时，在前20分钟要随时观察有无出现漏液的情况。（8）染色准备一个瓷盘，里面放入100ml的0.5TBE溶液，再加入30ul的EB溶液，两者充分混匀。将电泳完毕后的玻板之间的胶取出放入瓷盘中，染色30分钟以上后在紫外透射仪观察结果并拍照。3. 结果与分析3.1猪食道口线虫rDNA ITS-2的PCR扩增以引物(NC2和O5.8sF) PCR扩增食道口线虫rDNA ITS-2片段，其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，以DL2000 DNA Marker为对照，发现扩增片段大小约为400 bp，与预期目的片段长度相符，且无非特异性条带；空白对照为阴性。代表性样品琼脂糖胶电泳示意图1如下：图1 食道口线虫样品ITS-2 PCR扩增产物琼脂糖电泳分析1. OspYY2(岳阳); 2. OspCQa10 (重庆); 3. OspNX1(宁乡) ; 4. OspYJ6 (阳江) 5. OspCQa1 (重庆); 6.OspCQa9(重庆); 7. OspYJ5 (阳江); 8.OspYJ7I(阳江); 9. 宿主对照(猪); 10. 空白对照; M. DL2000 Marker3.2 Cold-SSCP结果PCR产物经处理后进行Cold-SSCP电泳（图2），结果显示来自我国不同地区的猪食道口线虫ITS-2片段的Cold-SSCP凝胶上出现两种明显的带型，与预期相符，表明这些食道口线虫样品分属于两个种，其中，样品OspYY2的带型存在多态性现象。 图2：食道口线虫样品ITS-2序列的Cold-SSCP电泳图1. OspYY2(岳阳); 2. OspCQa10 (重庆); 3. OspNX1(宁乡) ; 4. OspYJ6 (阳江) 5. OspCQa1 (重庆); 6.OspCQa9(重庆); 7. OspYJ5 (阳江); 8.OspYJ7I(阳江)3.3 ITS-2核苷酸序列分析Cold-SSCP鉴定结果与样品测序结果相符，以OspYj6V主带型为代表的样品序列分析证明为有齿食道口线虫样品，ITS-2序列全长为217bp，与国内已发表的有齿食道口线虫ITS-2序列核苷酸序列的相似性为100%11。以样品OspYj5V主带型为代表的样品其ITS-2序列长则为216bp，比有齿食道口线虫样品的ITS-2序列少1bp，核苷酸序列相似性为89.41%，与DNA数据库发表的四棘食道口线虫序列（O. quadrispinulatum，序列注册号为：Y11736）核苷酸序列的相似性为100%，证明为同一个种。在PCR-SSCP分析显示多态性的样品OspYY2 及OspNX，序列分析显示具有多态性位点，序列图显示双峰，Cold-SSCP结果样品OspYY2显示明显的多态性，而OspNX样品不显示多态性。4 讨论PCR是模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的聚合反应和扩增反应，以PCR技术为基础结合SSCP方法已成功地应用于多种寄生虫的分子鉴定和分类12-13。本项研究以采自重庆、湖南宁乡、阳江三个地方的猪食道口线虫作为研究对象，在研究序列片段的选择上，国内外许多的研究表明，ITS序列种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是研究寄生虫分类鉴定及遗传变异的理想标记14-16。ITS是核糖体DNA（rDNA）中介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括ITS-1和ITS-2两段序列，因此，因此本研究选用了ITS-1和ITS-2序列，以证明其是否能成为一个有效的遗传标记应用到这两种线虫的分类上。在研究方法的选择上，PCR-SSCP方法是基因突变检测的一种非常敏感的手段，也已应用到猪食道口线虫的分子鉴定上7，10，但用于需使用同位素，所以存在一定的生物安全性问题，国外研究显示，不需要同位素的Cold-SSCP方法敏感而安全，是一种很有前途的检测基因突变的方法17-18。研究结果显示以核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS-2）为遗传标记，结合Cold-SSCP方法能有效地鉴定有齿食道口线虫和四棘食道口线虫，得到与预期一样的结果；而以ITS-1序列为遗传标记的Cold-SSCP分析未能明显区分两种猪食道口线虫，因此在本项研究中，ITS-2片段作为遗传标记明显优于ITS-1片段。ITS-2片段的Cold-SSCP分析显示样品OspYY2存在多态性现象，而Cold-SSCP是一种敏感的基因突变检测技术，可检测到单个碱基的变异情况，此结果与PCR-SSCP结果相符。PCR-SSCP方法是基因突变检测的一种非常敏感的手段，相比之下，Cold-SSCP的灵敏性不如PCR-SSCP，在PCR-SSCP分析中显示多态性的样品OspNX在Cold-SSCP中未表现出多态性。此外，Cold-SSCP分析要取得良好效果，需要有足够量的PCR产物，但由于不使用同位素，Cold-SSCP具有简便，安全性高的优点，对实验者的人身安全有保障。本实验在国内外首次建立了猪食道口线虫的Cold-SSCP分子鉴定方法，为以后的寄生虫分类鉴定起了一定的导向作用并提供了一种较好的参考方法。本项研究的结果为今后食道口线虫，和一些形态学难以分别的寄生虫的分类、鉴别诊断、分子流行病学调查以及本病的防治等更深入的研究奠定基础。致 谢本研究是在指导老师朱兴全教授、林瑞庆老师的全面指导和帮助下完成的，与此同时还得到了我院兽医寄生虫学教研室宋慧群老师、研究生刘伟、本科生艾琳以及各位研究生的热心的帮助。本研究得到国家杰出青年科学基金项目（30225033）、教育部优秀青年教师资助计划项目和华南农业大学大学生科技创新活动项目的资助。谨对上述的和未提及的有关人士表示最衷心的感谢！参 考 文 献1 翁亚彪主编. 集约化猪场实用驱虫技术手册 M . 广东科技出版社，2003：9-112 汤明，聂奎，吴庆东，等. 重庆市畜禽寄生虫区系调查（一） J . 中国兽医寄生虫病，2003, 11（1）：25-303 阮正祥，王勤，曾志明，等. 贵州省毕节地区猪寄生虫区系调查 J . 中国兽医寄生虫病，2002, 10（3）：17-18 4 黄德生，李绍珠. 云南省家畜家禽寄生虫名录（4） J . 云南畜牧兽医，2002,（2）：14-19 5 Polderman A M , Blotkamp J. Oesophagostomum infections in humansJ. Parasitology Today, 1995, 11: 451-456.6 Diamond L S, Douvres F W. Bacteria-free cultivation of some parasitic stages of the swine nematodes Hyostrongylus rubidus and Oesophagostomum quadrispinulatum(O. longicaudum) J. Journal of Parasitology, 1962, 48: 39-42. 7 Gasser R B, Woods W G. Distinguishing Oesophagostomum dentatum from Oesophagostomum quadrispinulatum developmental stages by a single-strand conformation polymorphism methodJ. International Journal for Parasitology, 1999, 28: 1903-1909. 8 Cutillas C, Guevara-Martinez D, Oliveros R, et al. Characterizaion of porcine and ovine Oesophagostomum spp. by isoenzymatic patterns and retriction-fragment-length polymorphisms (RFLPs) J. Acta Tropica, 1999, 73: 59-71.9 Newton L A, Chilton N B, Beveridge I, et al. Systematic relationships of some members of the genera Oesophagostomum and Chabertia (Nematoda:Chabertiidae) based on ribosomal DNA sequence dataJ. International Journal for Parasitology, 1998, 28: 1781-1789.10 林瑞庆，张新高，李国清，等. 猪食道口线虫ITS-1和ITS-2 rDNA的PCR-SSCP分析 J . 中国预防兽医学报，2006,（3）：11 林瑞庆，陈丽莎，翁亚彪，等. 有齿食道口线虫ITS及5.8S的PCR扩增、克隆及序列分析 J . 中国农业科学，2005, 38(3): 639-642. 12 朱兴全，Robin B.Gasser. 以PCR为基础的分子生物学方法及其在寄生虫学方面的应用J. 中国兽医科技，1999, 29(4): 14-20.13 陈红玲，林瑞庆，朱兴全，等. PCR-SSCP技术及其