抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤.doc

抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤：（1）双链cDNA合成与酶切：分别提取待比较的两组细胞mRNA（实验方tester、驱赶方driver），利用随机引物反转录为双链cDNA后，用四碱基识别酶如RsaI或Hind切割成平均大小为600 bp左右的平端片段；该酶约在44=256 bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般600bp，可防止长链cDNA片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。（2）两次消减杂交：将tester cDNA分为两组，分别于其5端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头（adaptor1, adaptor2），以利于随后的选择性扩增。接头设计特点：接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10余个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3端与cDNA双链5端连接；接头长链外侧（约20余个核苷酸）序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。两组tester cDNA样品分别与过量的driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集，两组产物另加上新变性的drvier cDNA再次杂交，这样就产生了两个5端有两个不同接头的e型分子，这种e型分子正是tester较driver特异表达cDNA，填平粘性末端。第一次杂交中，将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。第一次杂交是使tester单链cDNA均等化，即是原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致。这种均等化的实现是依据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA。同时，由于tester cDNA中和driver cDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子c，使tester cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。第一次杂交后，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver单链，再次杂交退火。在这一次杂交中，只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester cDNA能与driver cDNA一起形成各种双链分子。这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5端有两个不同的接头（接头1和接头2），正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效的扩增。（3）两轮抑制性PCR：两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR原理进行扩增，将两个长接头序列设计成内外两对引物，先用外侧那对引物进行PCR反应。基于PCR抑制效应的存在，只有那些代表了具有差异表达的，且两端同时接有不同接头的双链cDNA片段（e型分子）才能在PCR中得到以指数扩增，而a、d类分子没有引物结合点，b类分子由于两端均为同一接头，在链内极易形成发夹结构，故此3类分子均不能得以扩增，而c类分子一端无接头，只能线性扩增。这样经过两轮PCR使差异表达的基因片段再次得到富集而构建成由差异cDNA片段构成的消减文库。换言之，e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高，而c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多，b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅-柄”二级结构，无法进行有效扩增。第二轮PCR再用内侧那对引物进行配对，可极大提高扩增的特异性，使在最后的PCR产物中绝大部分是e型分子。（4）消减文库的扩增与鉴定：将消减文库中的差异表达的cDNA片段以适当方式（T/A方式或酶切粘性末端互补方式）插入载体，转化细菌，扩增文库后，经x-gal蓝白斑/抗生素初步筛选后，随机挑取白色克隆制备质粒，酶切后分析插入片段。（5）对克隆出的片段进一步分析鉴定：包括用二次PCR产物制备探针，经点杂交筛选阳性克隆；以插入cDNA片段为探针进行Northern blot鉴定差异表达；cDNA序列测定，序列同源性分析；通过文库筛选或步移技术获取完整的差异表达基因全长。抑制性消减杂交技术较以往差异基因克隆方法有了重要改进，具有三者无法比拟的优点：（1）高度的特异性，这主要来源于以下三个方面的设计特点：a、使用四碱基识别酶酶切，产生600 bp的片段，这样可防止cDNA片段形成复杂结构而影响杂交，同时使同一基因家族来源的片段不易交互杂交，大大提高了片段的代表性，提高了基因克隆的效率，由于使用四碱基内切酶使得基因（组）的复杂程度降低，大大提高了信息量，在一次SSH实验中可同时分离出上百个差别表达的基因；b、应用两次消减杂交，将tester cDNA片段均与过量driver cDNA片段杂交，使差异表达基因的cDNA得到二次富集；c、充分应用了抑制性PCR和巢式PCR的原理，巧妙设计了两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸接头（adaptor1, adaptor2），这样不但使PCR扩增过程中两端均为同一接头的非特异性分子自我形成发夹结构而被大大抑制，而且在两轮PCR过程中依次分别使用与内外侧序列相吻合的引物，因此特异性地扩增代表差异表达的cDNA片段。SSH方法通过它的两次特异性杂交和两次PCR特异性扩增使得假阳性率大大降低。据德国Stein等报道，它的真阳性率高达94%（2）对低分度差异基因克隆的高灵敏性，SSH技术有一个归一化（normalization）过程。在第一次杂交过程中，由于杂交二级动力学的原因，高丰度的转录物易退火，这样高低丰度序列浓度趋于一致。实验证明，经过一轮减杂交即可对稀少的片段的几个分子富集达1000-5000倍，这样对低丰度的差异表达基因也能有效地克隆，这也使SSH技术成为大批量克隆新基因的有效方法，这是以往任何差异基因克隆方法远无法达到的。一般说来，经过SSH，稀有丰度cDNA能富集1000-5000倍，这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分子也有可能被检出；（3）筛选的简便性：SSH中方法中二次PCR产物可直接进行标记，成为Northern blot, Slot blot, Reverse blot, DNA sequence ，DNA芯片技术，文库筛选等后期实验的优质特异性的探针，大大减少了探针制备、纯化的繁琐过程。此类探针可与经过反向消减文库（将原tester作driver, 原driver作tester进行消减杂交）而获得的同类探针分别与克隆进行杂交，可迅速鉴定出假阳性克隆；此类探针也可与未消减的cDNA进行杂交，可迅速鉴定出消减后特异性表达的基因。（4）SSH方法简练、重复性好。此技术仅需1-2 g mRNA，而DD方法需20 g mRNA，消减杂交技术需至少200 g mRNA；操作熟练者可在7-14日内构建成功消减文库，获得差异表达基因cDNA片段，若使用增强剂如PEG，可进一步缩短实验时间；重复性好，假阳性率很低。但SSH对起始材料相对要求较多（需数微克），使其不适于来源困难的样品，且若为c