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微生物工程第一章 绪论名词解释:初级代谢产物：是与菌体生长相伴随的产物，主要是构成细胞高分子物质（蛋白质、核酸、多糖、脂类、维生素）的单体物质，如氨基酸、核苷酸、有机酸、脂肪酸等，一般不能过量积累，涉及合成代谢和分解代谢次级代谢产物：以初级代谢产物或中心代谢物为原料进行合成，与生长不相伴随，在菌体生长的稳定期合成，具有特定的功能，抗生素、生物毒素、胞外多糖微生物转化：利用微生物细胞的一种或多种酶把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物的生化反应.与初级代谢和次级代谢的不同与酶工程的不同微生物转化合成甾类激素，如可的松药物、抗生素的微生物转化简述：微生物工程发展的四个阶段及其标志性事件，每一时期生产的主要产品答: 1.自然发酵时期：传统发酵技术（酿酒，酱油，醋，面包，酸奶，奶酪等）2.纯培养技术的建立： 标志性的科学事件:虎克(A. Van Leeuwenhoek)发明显微镜（1680），巴斯德(L. Pasteur)发现发酵是由微生物引起的（1857），科赫(R. Koch)建立了固体培养基对微生物分离纯化的技术（1882) 主要生产厌氧发酵产品:甘油,乳酸,丙酮丁醇,和表面固体发酵生产少量的好氧产品：酵母菌体,柠檬酸3.深层培养技术的建立：以青霉素的液体深层需氧发酵技术的建立为标志(1943）,大规模发酵生产需氧发酵产品:维生素,抗生素,酶制剂,柠檬酸,甾类转化4.人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立，以60年代氨基酸、核苷酸微生物工业的建立为标志。用于氨基酸、核苷酸、有机酸和部分抗生素的生产5.基因工程技术的建立（1973）及自动化控制技术的应用第二章 工业微生物技术1、菌种衰退与复壮,自然选育,诱变育种 菌种衰退与复壮 衰退: 生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称为衰退1.引起菌种衰退的原因 (1)菌种遗传特性的改变：异核现象导致微生物菌种变异，自发突变导致菌种遗传特性改变，突变所产生菌种的回复突变以及杂交重组体产生分离子。 预防措施：减少传代次数，采用合适的菌种保藏方法 (2)菌种生理状况的改变：菌种的培养条件可以对菌种的生理状况产生影响，培养条件不当，可以引起菌种衰退2.防止菌种衰退的方法尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；尽量减少转代次数；采用幼龄菌种。复壮：菌种的复壮：将衰退的菌株恢复原有的生产性能复壮方法：纯种分离法、淘汰已衰退的个体、选择合适的培养条件自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程诱变育种：利用物理、化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进突变率大幅度提高，利用简便、快速、高效的方法筛选目的突变株1出发菌株的选择:有一定生产能力、生长快、产孢子多、营养要求低2诱变剂的使用方法：单独使用（对野生菌种效果较好）与联合应用（包括同一诱变剂多次处理，两种或以上诱变剂同时或多次处理效果较好eg.青霉素。氮芥，UV）3诱变剂量的选择：用致死率作为诱变剂量的的选择依据。一般，诱变率随诱变剂量的提高而提高，达到一定程度后再提高反而使诱变率下降，近年一般采用低剂量诱变。有时也使用高剂量，因其可引起巨大的损伤，形成稳定突变。4诱变菌株的筛选：初筛复筛发酵条件优化以确定最佳发酵条件2、主要发酵产品的生产菌种（柠檬酸，酒精，乳酸，谷氨酸，青霉素，丙酮和丁醇，淀粉酶，蛋白酶） 答：柠檬酸：黑曲霉（Aspergillus niger） 解脂假丝酵母（Candida lipoly）等。 酒精：ED途径的菌种：运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）嗜糖假单胞菌(Pseudomenas Sanccharophila)；酵母 乳酸：同型乳酸发酵：德氏乳杆菌（Lactobacillus delorckii）乳酸链球菌（Streptococcus lactis）异型乳酸发酵：肠膜状明串珠菌、短乳杆菌谷氨酸：谷氨酸棒状杆菌青霉素：金黄色葡萄球菌 985菌株 青霉菌丙酮和丁醇：羧状芽孢杆菌淀粉酶：枯草芽孢菌 ？蛋白酶：枯草芽孢菌3、常用育种方法及其特点，常用诱变剂及其育种原理 答：育种方法及其特点：自然选育：原理（自然选育一般由两种原因引起）：多因素低剂量诱变效应：在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。互变异构效应(自然突变) ：四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。特点：简单、效率低，常与诱变育种交替使用以提高育种效率。流程：常规的筛选流程：将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌株。应用:常用作菌种的复壮,以保持菌种的生产性能诱变育种：诱变育种一般步骤：出发菌株纯化细胞或孢子悬液的制备致死曲线测定活细胞计数中间培养突变株分离初筛复筛生产测试 菌种保藏原理：基因突变（染色体畸变、点突变、碱基转换(transition)、碱基颠换(transversion) 、移码突变）特点：方法简单、快速、效果显著，是主要的育种方法之一常用诱变剂及其诱变原理杂交育种：人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核生物的接合、F因子的转导、转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得优良的生产菌株。步骤：异核体的形成，双倍体的检出，单倍体的检出原生质体融合技术：利用人工方法（PEG融合或电击），使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子（杂合双倍体或单倍重组子）的过程，重组子可能同时具有两个亲本的优点融合子的检出方法：营养缺陷型标记、抗药性标记、双亲灭活、利用双亲对碳源利用不同、利用荧光染色法筛选融合子、生化指标分子育种：（1）代谢调控育种：代谢途径中关键酶的过量表达（插入新基因或增加基因拷贝）、失活（基因敲除、插入失活、点突变）、RNA干扰（ RNA i）。 基因敲除方法： （2）转基因微生物：大肠杆菌 酿酒酵母 毕赤酵母优点：重组频率大（10-1）、亲本选择范围大常用诱变剂： 物理诱变剂：紫外线、X射线、射线、激光、快中子化学诱变剂：丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄、原黄素等）和一系列ICR类的化合物a.与核酸碱基直接作用的诱变剂：烷化剂（EMS、NTG、NMU、EDS、氮芥）、亚硝酸、羟胺 b.碱基类似物：5-BU、5-FU、8-NG、2-AP c.移码突变诱变剂：生物诱变剂：噬菌体，转座子 各诱变剂既可单独使用,也可联合使用4、引起菌种衰退的原因，如何防治？答：1.引起菌种衰退的原因 (1)菌种遗传特性的改变：异核现象导致微生物菌种变异，自发突变导致菌种遗传特性改变，突变所产生菌种的回复突变以及杂交重组体产生分离子。 预防措施：减少传代次数，采用合适的菌种保藏方法 (2)菌种生理状况的改变：菌种的培养条件可以对菌种的生理状况产生影响，培养条件不当，可以引起菌种衰退 2.防止菌种衰退的方法A、尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；B、尽量减少转代次数；C、采用幼龄菌种5、微生物菌种保藏的原理，常见菌种保藏方法要点及其特点（斜面、穿刺、沙土管、真空冷冻干燥、液氮、低温）答：原理：人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态，减少菌种变异，达到长期保存的目的。保藏菌种状态：孢子，芽孢培养时间、培养温度、培养基成分保藏条件：低温，干燥、隔绝空气、缺乏营养物质常见菌种的保藏方法及其特点（P：77-80）要点是过程？6、同型乳酸发酵及异型乳酸发酵比较（菌种、产物、生化途径？）答：EMP：1、糖酵解途径（EMP）HMP：磷酸戊糖途径（HMP）7、酵母的三种发酵类型：发酵条件、发酵途径（要记？）、产物答：PPT第二章第三章 培养基及原料处理1、葡萄糖效应、生长因子、前体、发酵促进剂、发酵抑制剂、大曲（具体例子要不要知道如：黄血盐？）葡萄糖效应：葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢阻遏了某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。 生长因子：微生物正常生长代谢必不可少却又不能利用简单原料自行合成的有机物前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身结构没有多大变化，但产物的产量因前体的加入有较大的提高发酵促进剂：指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂发酵抑制剂：能抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃的添加剂大曲：大曲类型：高温曲，中温曲。高温曲生产工艺：2、用淀粉制备水解糖的方法有哪几种,各种方法有什么特点答：1.酸法水解:淀粉酸水解理论基础： 淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。 ？水解反应： 复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。 分解反应：葡萄糖羟甲基糠醛有机酸、色素等 酸种类: 硫酸:用量较多,用碳酸钙中和,易产生锅垢 盐酸:催化快，用量少,腐蚀性强 淀粉乳浓度:10-25B，淀粉颗粒均匀 温度:121-133 ，144-151 特点：速度快，设备简单，要求设备耐高温，副反应降低转化率2.双酶法：？ 液化:(1) -淀粉酶:淀粉1,4-糊精酶. 产物:麦芽糖,糊精 来源: 微生物(枯草杆菌,黑曲霉,米曲霉,根霉),植物,动物 (2)异淀粉酶糖化: (1)糖化酶:1,4-葡萄糖苷酶. 产物:葡萄糖. 来源：曲霉（55-60，pH3.5-5），根霉（50-55 ,pH4.5-5.5），拟内孢霉（50 ,pH4.5-5.0）； (2)-淀粉酶:1,4-麦芽糖苷酶. 产物:麦芽糖 来源：微生物:曲霉,根霉,内孢霉;大麦芽特点:反应条件温和,副产物少,转化率高，原料浓度高,产品质量高 时间长,设备要求多 3、 酸酶法:先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖,再用糖化酶水解为葡萄糖原料:玉米,小麦(颗粒坚实,酶法液化不彻底)特点:速度快，酸用量少,原料浓度高,产品质量高4、酶酸法：将淀粉乳用-淀粉酶液化到一定程度,然后用酸水解成葡萄糖的工艺（颗粒大小不一的淀粉原料(如碎米淀粉),酸法水解不均匀,出糖率很低,故先用酶 液化）.特点:可采用粗淀粉原料，生产时间短5.曲法:大曲,小曲,麸曲（具体见PPT，要知道？）3、常用于发酵培养基的碳源和氮源分别有哪些，各自有什么特点P：82-84 87-88答：（一）碳源1.功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础 2、 常用碳源及其特点及用途：碳酸气糖类:葡萄糖(葡萄糖效应)、 糖蜜、 乳糖、淀粉和糊精、纤维素有机酸和醇:甲醇、乙醇、丙三醇、山梨醇、乙酸钠油和脂肪 :烃:价格昂贵,但产物易提纯.3.快速利用的碳源和慢速利用碳源快速利用碳源：葡萄糖、蔗糖、氨基酸，乳酸（产酸，所以PH降得快，过低的PH不利于产物形成；碳源的迅速消耗引起菌体过早自溶。快速利用碳源可直接进入代谢途径而慢速利用碳源需经分解后再代谢故慢。一般单糖利用速度比双糖和多糖快。）（利于菌体生长但不利于产物合成）慢速利用碳源：乳糖、淀粉酵母不能直接利用淀粉、纤维素。(二)氮源1. 功能：用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为有机和无机氮源。2.常用氮源：有机氮源（慢速利用氮源）：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟 特点：利用慢，不会引起pH的快速波动,含有其他调节物质无机氮源： 铵盐：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵、氨水 硝酸盐：硝酸钾、硝酸钠特点：吸收利用快，迅速利用会引起PH值变化3.快速利用和慢速利用氮源的合理使用：P:88 氨基酸发酵过程中碳氮比要相对高些，否则只长菌体不产产物生理酸性物质和生理碱性物质的合理利用 ？4、培养基的优化方法答：见PPT第三章第四章1.名词解释:热阻,实消,连消热阻：微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热时间）的致死时间实消：即分批灭菌或称实罐灭菌，是指将配好的培养基放在发酵罐中，通入蒸汽进行灭菌的过程。连消：即连续灭菌，将配好的培养基在通入发酵罐之前进行加热、保温、降温的发酵过程。连续灭菌时培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一般高于批式灭菌温度，130140），短时间保温（58min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。2.灭菌时间的计算对数残留定律：Nt/N0=e-kt t=1/K lnN0/Nt=2.303/K lgN0/Nt 3.分批灭菌流程及其注意事项流程：预热、加热、保温、降温注意事项：夹套水要排干净罐内冷空气要排干净用夹套或蛇管预热至90左右再通蒸汽加热 加热时排气阀不要完全关闭,微开 冷却时一定保持罐内正压 泡沫或物料在罐壁残留会影响灭菌 分批时间的确定:p268？4分批灭菌及连续灭菌特点答：分批灭菌：无需专门的灭菌设备，设备投资少，效果可靠，对灭菌蒸汽要求低（0.20.3MPa表压）；但灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大、蒸汽用量波动大,操作难于实现自动化控制连续灭菌：优点:不占用发酵罐,设备利用率高。缺点:需要额外设备,蒸汽压力高5.简要说明无菌空气制备流程中各步骤的作用答：采风塔:采集含菌及杂质颗粒较少的空气粗过滤器:过滤大部分颗粒空气压缩机:提供空气压力空气贮罐：储存压缩空气冷却器：降低空气温度，使油、水露化气液分离设备（旋风分离器，丝网除沫器）：除油、除水加热器：降低相对湿度，提高空气温度 空气过滤器：是过滤除菌的关键设备6染菌原因分析及染菌后如何处理答：（1）按照染菌时间分析： 前期染菌：培养基灭菌不彻底，种子带菌；接种管道灭菌不彻底 中后期染菌：空气系统，补料系统，消沫系统带菌 （2）按照染菌规模分析：个别罐染菌：冷却系统渗漏，存在死角灭菌不彻底大规模染菌：空气系统，连消设备染菌（3）按染菌类型分 芽孢杆菌(存在灭菌死角)，非芽孢杆菌、球菌等不耐热菌(设备渗漏)，霉菌，革兰氏阴性菌(空气系统染菌)。第五章微生物菌种培养的一般流程答：PPT影响微生物种子质量的因素答：ppt第六章比生长速率、基质比消耗速率、产物比形成速率,稀释率D（作业）比较分批发酵,补料分批发酵及连续发酵的优缺点(作业)请指出Monod方程所描述的过程及适用条件,并说明方程中各参数的意义（作业）发酵分类（gaden分类法）及各类特点答：型发酵（生长联系型）:产物是直接由碳源代谢而来的初级代谢产物，产物生产速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化相平行,产物生产和糖的利用有直接的化学计量关系,产物形成与微生物的生长相偶联.菌体生长,碳源消耗,产物生成速度都有一个高峰,三个高峰几乎同时出现.如酒精发酵型发酵（部分生长联系型）：又称中间发酵型.产物不是碳源的直接氧化产物,而是菌体内生物氧化过程的主流产物，碳源既供微生物的生长又供产物合成,碳源利用率较高,糖的消耗主要在微生物的旺盛生长阶段和产物最大形成期,但糖的消耗与产物合成无直接计量关系，产物生成与微生物生长部分偶联.如柠檬酸发酵型发酵（