南京农业大学考研生化试验.doc

精品文档 实验一 缓冲液配制和pH值测定 实验二 荧光光度法测定核黄素的含量 实验三 茚三酮比色法测定赖氨酸含量 实验四 考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量 实验五 2,6-二氯酚靛酚滴定法测定L-抗坏血酸的含量 实验六 间隔法测定过氧化物酶的活力 实验七 连续记录法测定过氧化氢酶的活力 实验八 纸电泳分离鉴定三种腺苷酸 综合性开放实验一. 目的 了解配制缓冲液和pH计的基本原理。 掌握配制缓冲液和使用pH计的基本方法。二. 原理 在一定的酸或碱作用下，能够自动调整和保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。以HAc和NaAc组成的缓冲液为例，它的pH符合下面关系：pH= p Ka -lgHAc/Ac-，因此改变HAc/Ac-的比值，可以在一定范围内配制不同pH值的缓冲液。缓冲液的缓冲容量大小不仅与其总浓度有关，而且与其组分比也有关。总浓度越大，缓冲容量越大；总浓度一定，其组分浓度比越接近1，缓冲容量越大。缓冲液适当稀释或浓缩，其pH值基本保持不变。 测定pH值的pH计（或称酸度计），一般是由一支对H+敏感的玻璃电极和一支不随溶液中被测离子活度变化而改变其本身电位的甘汞电极以及一个测量电位的电位计所组成，两支电极和测试溶液构成一个伏特电池，电极在不同的pH值溶液中产生不同的电位，它符合电化学理论中的Nernst方程，即E = E0-(2.303RT/F)pH。测定中，首先测得已知pH的标准缓冲液中产生的电位Es，然后，由测得未知pH缓冲液中产生的电位Ex通过公式可直接算出该缓冲液的pH（pHx）。为了方便，pH计上装有一个定位调节器，当测量标准缓冲液pH时，利用它可把读数直接 指示在标准的pH值上，这样在以后测未知pH的缓冲液时，该电位读数也就直接表示相应的pH值。在本实验使用的Beckman F61 pH计计中，以上过程均由仪器自动完成。三. 实验试剂及设备 1. 试剂 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O） 冰醋酸、醋酸钠（NaAc3H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris） 甘氨酸、盐酸、标准pH缓冲液（pH4.01、7.00、10.01） 2. 仪器 电子天平（感量0.001g） pH计 3. 器材 容 量 瓶： 100mL2 量 筒：50mL1 移 液 管： 10mL1 烧 杯： 100mL1 200mL2 漏斗、洗瓶、洗耳球、移液管架、玻棒：各1四. 操作步骤 1. 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH7.0） (1) 由附录“常用缓冲溶液的配制”表中通过计算，分别称取Na2HPO412H2O g，NaH2PO42H2O g，用蒸馏水溶解后，定容至100mL。 (2) 将配好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。 2. 醋酸-醋酸钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH5.4） (1) 0.1mol/L醋酸钠母液的配制：称取NaAc3H2O g，用蒸馏水溶解后，定容至50 mL。 (2) 0.1mol/L醋酸母液的配制：吸取冰醋酸 mL，用蒸馏水定容至1000mL。 (3) 取0.1mol/L醋酸钠母液43mL，0.1mol/L醋酸7mL，于烧杯中混匀，用pH计测定pH值，使混合液的pH值最终达到5.4。 (4) 将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。 3. Tris-Gly-HCl缓冲液配制（0.025mol/L，pH8.3 ） (1) 称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.300g，甘氨酸1.44g，加入80mL蒸馏水，加热溶解。 (2) 冷却后，用pH计测定pH值，并不断滴加2.5mol/L盐酸，使pH值最终达到8.3。 (3) 用蒸馏水定容至100mL。 (4) 将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用五. 思考题 1. 配制缓冲液时，选取合适的缓冲试剂，主要根据什么原则？ 2. 配制缓冲液，常用的方法有哪几种？一. 目的 了解荧光法测定核黄素的原理和方法。 学习荧光光度计的操作和使用。二. 原理 核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐等还原成无色的二氢化物，同时会失去荧光，因而检测样品时要防止荧光的衰减。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：图2 核黄素氧化还原机理图 核黄素的激发光波长范围约为440500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510550nm（一般为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。 注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。三. 实验材料及设备 1. 材料 核黄素药片 2. 仪器 荧光光度计 天平（感量0.0001g） 3. 器材 普通试管： 25mL10 容 量 瓶： 100mL2(棕色) 移 液 管： 10mL1 5mL1 1mL1 烧 杯： 50mL2 250 mL1 滤 纸： f11cm 滴 管：2支 坐标纸、研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制 核黄素标准液（5g/mL） 准确称取核黄素10mg，加100mL浓度为1.71mol/L的醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水定容至2000mL。转入棕色瓶中。五. 操作步骤 1. 样品液的制备 (1) 取样：取核黄素药片一粒，称重 g；转入研钵中磨成粉。 (2) 定容：加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至100mL。 (3) 过滤：收集部分滤液于试管中。 (4) 稀释：取滤液2mL于棕色容量瓶中，定容100mL，待测。 （本实验由于样品溶解后所剩残渣很少，残渣所占体积对定容体积100mL造成的误差可以忽略不计，所以采用先定容，后过滤操作过程，这样可以节省时间。） 2. 标准曲线制作及样品测定 取9支试管，按下表所示顺序操作。注意: 在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数或调节灵敏度。六. 结果处理 1. 由16号管的数据，以核黄素含量(mg)为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 2. 求样品管F的平均值； 3. 由从标准曲线中求样品管中核黄素的含量(g)； 4. 计算你所取生物材料中核黄素的含量（单位用g/g鲜重）。七. 思考题 为什么在核黄素的整个测定过程中，需要避光操作？附注（荧光光光度计使用说明） 使用930型荧光光度计时：核黄素荧光测定的激发光波长为440nm，发射光波为520nm。因此可选用带通型400nm（蓝字）滤色片为激发光滤色片，选用截止型510nm（红字）滤色片为发射光滤色片。 待仪器预热并调好零点后，用参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度（100%），然后分别测定其它溶液的相对荧光强度F值。 使用F96型荧光光度计时：需用“0”管的溶液调F=0.00，再分别测定其它的中溶液的F值。一. 目的了解赖氨酸总含量的测定方法。掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。二. 原理 蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的e-NH2，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，在波长570nm处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。 亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，它仅有的一个氨基（a-NH2）相当于蛋白质中赖氨酸残基上的e-NH2，因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比（赖氨酸与亮氨酸分子量之比为1.11:1）。式中 W：样品质量 C ：样品中游离氨基酸的量，各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是：玉米：0.01%，高粱：0.04%，水稻：0.01%，小麦：0.05% X ：从标准曲线查得的赖氨酸的质量三. 实验材料及设备 1. 材料 玉米粉 2. 仪器 分光光度计 分析天平 恒温水浴 3. 器材 刻度试管： 25mL11 移 液 管： 1mL1 2mL2 20mL1 烧 杯： 250mL2 50mL1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 滤 纸： f11cm 研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制 1. 柠檬酸缓冲液（0.2mol/L，pH5.6）(参见附录二) 2. 茚三酮试剂 称3g茚三酮溶于100mL 95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化锡，搅拌溶解后加入100mL柠檬酸缓冲液中，搅匀备用。 3. 亮氨酸标准液（50mg/mL） 准确称取5mg亮氨酸，用蒸馏水稀释定容到100mL，则得浓度为50mg/mL的标准液。五. 操作步骤 1. 样品液的制备 (1) 取材：称取烘干、粉碎（过80目筛）的玉米粉0.3g（油料种子须经脱脂处理）。 (2) 提取：将称取的样品放入试管，准确加入20mL蒸馏水，摇匀。读取样品悬液的总体积 mL，置于80恒温水浴中提取20min。（可间歇摇动） (3) 定容：冷却后，用蒸馏水将试管中悬液定容至（2）中悬液总体积刻度 mL,，即最终样品液总定容体积仍为20mL，摇匀。 (4) 过滤：将提取液用滤纸过滤，收集滤液作为待测样(滤纸不能用蒸馏水湿润)。 2. 标准曲线制作及样品测定 取9支刻度试管，按下表所示顺序操作。六. 结果处理 1. 由06号管的数据，以亮氨酸含量(mg)为横坐标，A570为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 2. 求样品管A570的平均值570； 3. 由530从标准曲线中求样品管中赖氨酸的含量(mg)； 4. 计算你所取生物材料中赖氨酸的含量（单位用mg/mg样重）。七. 思考题 1. 能否运用线性回归方程的方法，计算样品中赖氨酸的百分含量？ 2. 运用本实验方法测定含油份高的作物种子时，为什么对样品要进行脱脂处理？ 3. 分析本实验中可能引入误差的几个关键环节。一. 目的 学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。二. 原理 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。 由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。三. 实验材料及设备 1. 材料 包心菜 2. 仪器 分光光度计 离心机 电子天平 3. 器材 刻度试管： 25mL9 刻度试管： 10mL1 移 液 管： 1mL3 20mL1 烧 杯： 250mL2 50mL1 离 心 管： 10mL1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 坐 标 纸 研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制 1. 牛血清白蛋白(BSA)标准液（100mg/mL）精确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。 2. 考马斯亮蓝G-250染色液取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存1个月。五. 操作步骤 1. 样品液的制备 (1) 取材：称包心菜叶片1.0g左右，准确记录其质量g。 (2) 研磨：将样品置于研钵中，研磨成匀浆后，准确加20mL蒸馏水。 (3) 提取：将上述匀浆液在研钵内浸提10分钟，不断搅拌，使蛋白质充分溶解在水中（注意，已定容，所以在没搅匀之前不能损失样液）。 (4) 离心：将部分浸提液转移到10mL离心管里，以10000转/分钟离心10分钟。 (5) 分离：将上清液倒入至干净的小试管里，备用。（对于含水量比较多的样品，在计算定容体积时，还应考虑到样品本身的水份。因此，另取1g左右的包心菜叶片，准确称重 g，在微波炉里高温失水，冷却后准确称重 g，计算包心菜叶片的含水量，然后再计算出所称样品中含有 g（mL）水，加上20mL水的体积，就是本实验样品的准确定容体积。） 2. 标准曲线制作及样品测定 取9支试管，按下表所示顺序操作。六. 结果处理 1. 由05号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 2. 求样品管A595的平均值A595； 3. 由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg)； 4. 计算你所取生物材料中蛋白质的含量（单位用mg/g鲜重）。七. 思考题 1. 用本实验方法所得的测定值与样品的实际值之间若有误差，主要是由什么原因引起的？ 2. 常见的测定蛋白质的方法还有哪些？比较几种测定蛋白质常用方法的优缺点？一. 目的 掌握滴定法测定Vc含量的基本原理和操作。二. 原理 L-抗坏血酸（Vc）中的C=C基具有还原性，还原型L-抗坏血酸能与氧化剂染料2,6-二氯酚靛酚作用，染料本身被还原成无色的衍生物，同时还原态的L-抗坏血酸被氧化成无色的脱氢L-抗坏血酸。 一定量的样品提取液还原标准染料的量与样品中所含Vc的量成正比。染料2,6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈粉红色。 用2,6-二氯酚靛酚滴定样品，在达到终点之前，滴下的2,6-二氯酚靛酚立即被还原成无色；当溶液中的L-抗坏血酸被消耗完时，滴下的过量的2,6-二氯酚靛酚在酸性体系里呈现粉红色。所以当溶液从无色转变成微红色时，即为滴定终点。三. 实验材料及设备 1. 材料 新鲜蔬菜 2. 仪器 电子天平 3. 器材 滴 定 管： 25mL1 移 液 管： 10mL2 20mL1 容 量 瓶： 100mL1 量 筒： 50mL1 锥 形 瓶： 100mL4 研 钵： 1套 烧 杯： 250mL2 50mL1 洗 瓶： 1个 纱 布： 20cm20cm 1块四. 试剂的配制 1. 草酸溶液（2%） 每组配制250mL 2. 2,6-二氯酚靛酚溶液 分别称取2,6-二氯酚靛酚300mg、碳酸钠300mg，用热蒸馏水200mL溶解并定容至3000mL（过滤除去难溶颗粒，置于棕色瓶中，贮于冰箱中备用。有效期一周，使用前需标定，见附注。）五. 操作步骤 1. 样品液的制备 (1) 取材：称取新鲜黄瓜10g左右，准确记录称样量 g,再称量2.5g草酸， 与样品一起用纱布包裹住。 (2) 研磨：样品包置研钵中，加15mL2%草酸，用研棒挤压样包，将样品充分磨细。 将汁液转移到100mL容量瓶中。残渣再加15mL2%草酸，继续研磨，汁液再合并到上述容量瓶中。如此反复研磨23次，合并汁液。 (3) 定容：最后用2%草酸定容至V=100mL，摇匀备用。 2. 样品的测定 吸取汁液20mL，放入100mL锥形瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现粉红色在15秒内不消失为止。记录所用滴定液体积。平行操作三次得V1= mL，V2= mL，V3= mL，取平均值V= mL。 3. 空白测定 取2%的草酸液20mL，放入另一100mL锥形瓶内，用2,6-二氯酚靛酚滴定至终点，记录染料用量V0。六. 结果处理 计算你所取生物材料中Vc的含量（单位用mg/100g鲜重）。七. 附注 2,6-二氯酚靛酚钠溶液的标定： 准确称取Vc 20mg，用2%草酸溶解定容至1000mL。 吸取稀释液20mL，放入100mL锥形瓶中,立即用所要标定的2,6-二氯酚靛酚滴定至粉红色出现15秒不消失为止，记录所用毫升数，按下式计算K值（即1mL染料所能氧化抗坏血酸的毫克数）。式中 G：称取Vc的毫克数 V：滴定20mL标准Vc时所用染料液的毫升数与滴定空白所用毫升数之差值。 1. 操作要尽可能快，并防止与铁铜器具接触，以减少维生素C的氧化。 2. 草酸及样品的提取液避免日光直射。 3. 当样液本身带色时，测定前于提取液中加23mL二氯乙烷。在滴定过程中当二氯乙烷由无色变为粉红色时，即达终点。八. 思考题 用滴定法测定生物材料中Vc的含量有什么优缺特点?一. 目的 掌握间隔法测定过氧化物酶活力的原理及操作方法二. 原理 过氧化物酶（peroxidase，POD，EC 1.11.1.7）是以铁卟啉为辅基的氧化酶，催化H2O2氧化某些酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质。它广泛分布于生物界，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，如清除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白以及促进植物细胞木质素的形成等。 本实验以愈创木酚（邻甲氧基苯酚）和H2O2为底物，过氧化物酶催化H2O2放出新生态氧，使无色的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚，反应式如下：过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，该产物在460nm有最大的光吸收，故可通过测定A460的变化来测定过氧化物酶的活力。这里规定，一个过氧化物酶活力单位为在室温、pH5.4的条件下，酶反应体系中每分钟A460的增加值为1所需的酶量。 活力测定时，酶反应在分光光度计的比色杯内进行，由于酶反应产物增加而使A460增加，通过定时间隔记录可获得一组A460值。以时间为横坐标，A460值为纵坐标进行线性作图（或用统计方法求得回归方程），进而计算A460的变化速率（DA460min-1），最后计算每克鲜重样品中过氧化物酶活力的大小。三. 实验材料及设备1. 材料 禾本科植物叶片2. 仪器 电子天平 高速冷冻离心机 分光光度计 冰浴3. 器材 刻度试管： 10mL1 移 液 管： 5mL1 微量进样器：200ml 1000ml 烧 杯： 250mL2 50mL1 离 心 管： 7mL1（带盖） 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 硫 酸 纸 研钵、剪刀、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制 1. 酶提取缓冲液 50mmol/L、pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，内含5mmol/L亚硫酸氢钠和1%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)（临用前加）。 2. 酶活力测定缓冲液 0.1mol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液 3. 愈创木酚溶液（0.25%W/V）（溶于50%乙醇中）（临用前配制） 4. H2O2溶液（0.75%）（临用前配制）五. 操作步骤 1. 酶液的制备 (1) 取材：称取0.5g左右叶片，记下实际质量 g。 (2) 研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的酶提取缓冲液5mL，置冰浴上充分研磨。 (3) 离心：匀浆液全部转入塑料离心管，于4下、以10,000g离心15min。上清液全部倒入试管，此上清液即为粗酶液，待测。 2. 酶活力测定 (1) 将分光光度计预热10min，波长定于460nm处。 (2) 在玻璃比色杯内，先加入2mL醋酸-醋酸钠缓冲液和1mL 0.25%愈创木酚溶液， 再加入0.05mL或0.1mL酶液（视酶活力大小而定），最后加入0.1mL 0.75%H2O2溶液，用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀。 (3) 立即把比色杯插入比色架，关盖。迅速把A460调至0并开始记时，每隔30秒读取并记录A460值，共读3分钟。（注：酶液加入量一般控制在5min内使A460达到0.50.8为宜）六. 结果处理 1. 以时间为横坐标，A460值为纵坐标，对所得数据进行线性作图（或用统计方法求回归方程）； 2. 求出上图中所作直线（或回归方程）的斜率，即A460min-1，此为反应的初速度； 3. 求出每克鲜重植物样品中过氧化物酶的活力单位，以Ug-1FW表示。七. 思考题 1. 酶活力测定为什么必须测定酶反应的初速度？ 2. 在本实验的酶提取和酶活力测定时，为什么用不同的缓冲液？一. 目的 了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法 掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算二. 原理 过氧化氢酶（Cata1ase，CAT，EC 1.11.1.6）是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除H2O2的重要酶之一，其催化的反应为： 通过上述反应，CAT可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。 传统测定CAT活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且比较复杂。本实验采用紫外分光连续记录测定法，具有操作简单，灵敏度高，结果直观的优点。 测定时，酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行，分光光度计与记录仪相连接，由于H2O2在240nm处有吸收峰，加入酶液后会使A240下降，而A240下降的情况又可以记录在纸上，从记录的初始直线段计算A240的变化速率DA240min-1，最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出DA240min-1g-1Fw并以此来表示样品中CAT活力的大小。三. 实验材料及设备 1. 材料 小麦叶片（或其它禾本科植物叶片） 2. 仪器 电子天平 高速冷冻离心机 记录仪 紫外分光光度计 3. 器材 层 析 柱： 1套 刻度试管： 5mL10 移 液 管： 5mL1 微量进样器：1000ml1 200ml1 （可调） 塑料离心管：7mL1 小 试 管：1支 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 硫 酸 纸 研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制 1. 提取缓冲液（0.05mol/L、pH7.0 PBS，内含l%PVP） 2. CAT反应液(0.05mol/L、pH7.0 PBS，内含0.015mol/L H2O2) 3. 层析介质：Sephadex G-25五. 操作步骤 1. 粗酶液的制备 (1) 取材：称取0.5g左右的生物材料，记下实际质量。 (2) 研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的提取缓冲液5mL，置冰浴上充分研磨。（如不易研磨，加少量石英砂。） (3) 离心：匀浆液全部转入7mL塑料离心管，平衡后于4下、以10,000g离心10分钟。上清液全部倒入刻度小试管，准确记下其体积，此上清液即为粗酶液，置于冰浴中备用。 2. 粗酶液的初步纯化 （1）上样：用可调微量进样器或移液管吸取1mL粗酶液过Sphadex G-25小柱（总床体积7mL）（参照“凝胶层析脱盐”实验的上样步骤）。 （2）收集：每管收2mL，共收集4支试管，然后关闭出口。 （3）检测：将收集到的洗脱液每管取0.4mL到相应的另一支空试管中，用考马斯亮蓝检测是否有蛋白质。 （4）合并：将检测到含有蛋白质的对应的几支管等体积混合，摇匀，即为初步纯化的粗酶液，置于冰浴中备用。 3. 酶活力测定 (1) 紫外分光光度计与记录仪相连接，波长定于240nm处，记录仪的量程定于 50mV处，预热10min，仪器调零。 (2) 在光径为1cm的石英比色皿内，先加入3mL CAT反应液，再加0.1mL的粗酶液或初步纯化的粗酶液后（视酶活力大小而定），用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀数次（不要过分剧烈颠倒）；立即把石英比色皿插入比色架上，关盖，同时将记录仪的纸速开关拨至4mm/min处，A240的变化情况被记录于纸上。3min后关闭纸速开关。 (3) 重复步骤（2），再测定12次。六. 结果处理 1. 在记录纸上取实验记录得到的直线一段，计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值，得A240min-1，（记录纸的纵轴为时间分钟，横轴为光吸收A240），该余切值代表酶反应的初速度，最后取重复测定的平均值； 2. 根据活力测定的酶液加入量、酶液总体积和样品鲜重，计算植物样品中CAT活力，以A240min-1g-1Fw表示（包括粗酶液与初步纯化的粗酶液）。七. 思考题 1. 什么是酶反应进程曲线？它对酶活力测定有何意义？ 2. 什么是酶浓度曲线？它对酶活力测定有何意义？ 3. 粗酶液与初步纯化过的粗酶液过氧化氢酶活力哪个大？为什么？如果要计算纯化倍数，还应该做哪些工作，并如何计算？一. 目的了解纸电泳法分离带电颗粒的原理观察核苷酸类物质的紫外吸收现象二. 原理带电荷的物质在电场中向阳极或阴极移动的现象称为电泳。控制电泳条件，使混合样品中的不同组份带不同电荷，因而各组份在电场中移动方向或速度各不相同，从而达到分离目的。以滤纸作支持物的电泳称为纸电泳。本实验用纸电泳法分离腺一磷（AMP）、腺二磷（ADP）、腺三磷（ATP）。在pH4.8的电泳缓冲液中，由于三种腺苷酸带有不同量的磷酸基团，它们解离后，带有负电荷量的顺序为：ATPADPAMP，故能通过电泳在滤纸上得以分离。利用核苷酸的碱基具有紫外吸收性质，将分离后的电泳纸放于紫外灯下，参照标准品，对组份进行鉴定。三. 实验材料及设备1. 材料ATP药片2. 仪器电泳仪 电泳槽（水平式） 紫外检测仪 电吹风3. 器材电泳滤纸：新华1号滤纸条：2cm25cm移 液 管：2mL1洗 耳 球：2研钵、洗瓶、移液管架、滴管：各1铅笔、尺、毛细管、镊子四. 试剂的配制1. 柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8）称取柠檬酸12.08g，柠檬酸钠19.85g，溶于蒸馏水，定容至2500mL。2. 标准腺苷酸溶液用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP分别配成100mg/10mL溶液（当日配置，置冰箱备用）。五. 操作步骤1. 样品液的制备取一粒ATP药片于研钵中，加2mL水研磨备用。2. 点样取25cm2cm的滤纸条放在一张清洁的点样衬纸上，在距滤纸条一边7cm处用铅笔轻划一点样线，作记号。用毛细管依次将标准液及混合液点于记号处，注意斑点直径勿超过2mm，每样点23次，每点一次用冷风吹干。3. 电泳将滤纸平整地放在电泳槽的滤纸架上，纸两端浸入电极缓冲液中。用滴管将电泳缓冲液（pH4.8）均匀地滴于纸上（点样处最后湿润）。盖上电泳槽盖，接上电极，点样端接负极；接通电源，调电压至300V，室温通电2小时；电泳完毕后，关闭电源，取出滤纸，将其用冷风吹干。4. 鉴定在暗室条件下，将干滤纸置于紫外灯下观察，用铅笔将各斑点划出。并测定各斑点的迁移距离。六. 结果处理1. 画出标样和未知样品的电泳结果示意图； 2. 以三种标准腺苷酸的迁移距离值作标准，鉴定样品中斑点所代表的核苷酸种类。七. 思考题在纸电泳中如何尽量减小样斑的扩散？激发学生的实验兴趣，在课余时间学习更多的知识，提高学生的实验技能和创新能力，其主要形式有：学生根据个人兴趣和发展方向，查阅资料，自选实验；实验指导教师选定一些实验，学生自由组合选做；由实验教师指定实验项目，学生自行设计。参考实验项目(1) 钼酸铵比色法测定Vc的含量(2) 2,6-二氯酚靛酚测定Vc的含量(3) DNA与RNA的提取分离及颜色反应(4) 糖的还原作用(5) 考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质的含量(6) 鸡蛋中(蛋清、蛋黄)蛋白质的测定(7) 不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(8) 从牛奶中分离制备酪蛋白(9) 蛋白两性反应和等电点测定(10) 双缩脲法测定蛋白质含量(11) 蛋白质颜色反应(12) RNA的提取与pH的关系(13) 盐析测蛋白质含量(14) 测定物质中游离的氨基酸浓度(15) 苯酚法提取RNA并紫外吸收法测含量(16) 血糖的定量测定(17) 一定时间唾液淀粉酶体外水解淀粉产物的测定(18) 酶促转氨反应(19) 丙酮酸含量的测定(20) 酪蛋白等电点测定(21) Tales微量快速乳糖测定(22) 猪肝脏DNA的提取纯化及鉴定(23) 利用酶观察不同条件下失活的蛋白质能否复活(24) Lineweaver-Burk作图法测定唾液淀粉酶Km值(25) 蛋白质沉淀反应和两性反应(26) 唾液淀粉酶比活力的测定(27) 碘价的测定(2