结构基因组学PPT课件.ppt

结构基因组学 1 基因组学的基本概念 基因组作图与测序的原理和方法 重点 2 结构基因组学 1 概念和目的2 基因组作图遗传图谱物理图谱转录图谱序列图谱3 基因图谱 3 概念和目的 以全基因组测序为目标的基因结构研究弄清基因组中全部基因的位置和结构 为基因功能的研究奠定基础 其目的是建立高分辨的遗传图谱 物理图谱 转录图谱和序列图谱 一个生物体基因组的最终图就是它的全部DNA序列 4 结构基因组学主要任务基因组作图 遗传图谱 连锁图谱 物理图谱转录图谱序列图谱 分子水平的物理图谱 5 遗传图谱 6 遗传图谱 连锁图谱 概念 指基因或分子标记在染色体上的相对位置与遗传距离 用厘摩 cM 表示 cM含义 1cM的遗传距离表示在100个配子中有1个重组子 在哺乳动物中 遗传图谱上1cM的距离大约相当于物理图谱上1000000bp 7 用途 通过该图谱可分清各基因或分子标记之间的相对距离与方向 如靠近着丝粒或端粒注意 该图谱的构建是以位于同一染色体相邻的2个基因或遗传标记的重组率为基础 因而需要有参考家系和分子遗传标记或基因作为研究基础 8 一 遗传图谱与遗传标记 遗传图谱采用遗传分析的方法将基因或其他DNA序列标定在染色体上构建连锁图 什么是遗传标记 有可以识别的标记 才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置 9 遗传图谱 通过遗传重组所得到的基因线性排列图称为遗传连锁图 它是通过计算连锁的遗传标记之间的重组频率 确定它们的相对距离 cM 物理图谱 是利用限制性内切酶将染色体切成数个片段 根据重叠序列把片段连接成染色体 确定遗传标记之间物理距离 碱基对 bp 或千碱基 kb 或兆碱基 Mb 的图谱 10 要构建构建遗传图谱 需要寻找基因组不同位置上的特征标记 遗传标记 包括 1 形态标记 2 细胞学标记 3 生化标记 4 DNA分子标记 11 二 标记的多态性 所有的标记都必须具有多态性花色 白色 红色身高 高 矮血型 A B O型淀粉 糯 非糯所有多态性都是基因突变的结果 12 1 形态标记 形态性状 株高 颜色 白化症等 又称表型标记控制性状的其实是基因 所以形态标记实质上就是基因标记 态标记的特征 数量少很多突变是致死的受环境 生育期等因素的影响 13 14 2 细胞学标记 明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 染色体的核型染色体的带型染色体的结构变异染色体的数目变异优点 不受环境影响缺点 数量少 费力 费时 对生物体的生长发育不利 15 3 生化标记 又称蛋白质标记 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记 如同工酶优点 数量较多 受环境影响小缺点 受发育时间的影响 有组织特异性 只反映基因编码区的信息 16 夏腊梅同工酶谱照片 17 4 DNA分子标记 简称分子标记 以DNA序列的多态性作为遗传标记随着分子生物学的发展 相继建立了RFLP TRS SNP等多种分子遗传标记检测技术 开创了遗传标记研究的新阶段 优点 不受时间和环境的限制遍布整个基因组 数量无限不影响性状表达自然存在的变异丰富 多态性好共显性 能鉴别纯合体和杂合体 18 遗传作图的标记 Settheflagsonthegenomes 19 染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标 路标具有物理属性 他们由特定的DNA顺序组成 路标位于染色体上的位置是固定的 不会更改的 因而提供了作图的依据 20 三 分子标记类型 RFLP 第一代 限制性片段长度多态性TRS 第二代 串联重复序列标记SNP 第三代 单核苷酸多态性 21 1 RFLP的原理 利用限制性内切酶消化基因组DNA 形成大小不等 数量不同的分子片段 酶切位点的改变 会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性 22 PCR RFLP 将PCR产物术用于RFLP分析 即PCR RFLP 该技术先用1对引物特异性扩增基因组的某一高变区 然后用限制性内切酶消化PCR产物 电泳检测多态性 23 PCR RFLP的应用 CCTGAGGAG CCTGTGGAG Mst 酶切位点 Mst 酶切位点消失 24 2 TRS 真核生物基因组中的可变串联重复序列 variablenumbertandemrepeatedsequence VNTR 有两类 小卫星和微卫星 两者具有高度的变异性 25 VNTR示意图 123 VNTR变异的原理示意图 26 DNA指纹图谱原理 选择在VNTR特异序列上没有酶切位点的限制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度的片段 以VNTR中特异序列作为探针 进行Southern杂交 由于不同个体的串联重复序列的数目和位置不同 形成的杂交谱带具有个体的特异性 人们称为DNA指纹图谱 27 28 3 小卫星DNA 小卫星重复单位的核心序列为15 76bp近缘物种和个体间的小卫星核心序列有着一定的同源性 在一定的条件下可以相互杂交 29 4 微卫星DNA 又称简单序列重复 simplesequencerepeat SSR 是高度重复序列 广泛存在于真核生物基因组 重复单位的核心序列为2 6bp 30 微卫星遗传标记的原理 以微卫星DNA标记两侧特异性序列设计专一引物 通过PCR技术扩增微卫星片段 扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 不同个体间因核心序列的重复次数不同而产生DNA多态性 31 微卫星遗传标记示意图 PCR扩增 凝胶电泳 32 5 SNP 是指染色体上的某个存在单个碱基的变化 包括单碱基的转换 颠换 插入及缺失等 33 遗传图谱的构建方法 理论基础 连锁与交换基本方法 两点测验法和三点测验法 34 四 遗传图谱的构建 35 遗传图谱构建的步骤 选择适合作图的DNA标记 根据遗传材料之间的DNA多态性 选择用于建立作图群体的亲本组合 建立具有合适的分离群体 测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型对标记基因型数据进行连锁分析 构建标记连锁图 36 1 亲本的选配首先要考虑亲本间的DNA多态性 选择亲本时应尽量选用纯度高的材料 要考虑杂交后代的可育性 37 2 分离群体大小的选择 一般选用F2代分离群体遗传图谱的分辨率和精度 很大程度上取决于群体大小 群体越大 则作图精度越高 但群体太大 不仅增大实验工作量 而且增加费用 因此确定合适的群体大小是十分必要的 合适群体大小的确定与作图的内容有关 从作图效率考虑 作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面 是从随机分离结果可以辨别的最大图距 是两个标记间可以检测到重组的最小图距 38 3 图谱构建的理论基础 基因重组和连锁理论遗传图谱构建的理论基础是染色体的交换与重组基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起基因的重组是通过一对同源染色体的两个非姊妹染色单体之间的交换来实现的 39 ShC shc 二分体 ShC ShC ShC ShC ShC shc shc shc shc shc shC Shc CSh CSh CSh cSh Csh csh csh csh 四分体 全部亲组合占94 3 亲组合3 重组合 6 细胞交换 F1 新 新 新 shc shc ShC ShC P1 P2 94 细胞无交换 40 假设某一对同源染色体上存在Sh sh C c两对连锁基因 现有两个亲本P1和P2 它们的基因型分别为ShShCC和shshcc 两亲本杂交产生ShshCc双杂合体 F1在减数分裂过程中应产生4种类型的配子 其中两种为亲型配子ShC和shc 两种为重组型配子Shc和shC 由于Sh sh和C c位于同一染色体上 要产生重组型配子必须在这两个基因的连锁区段上发生交换 41 1 遗传图谱构建原理 基因连锁与互换定律遗传图谱 基因或标记的排序与遗传距离 物理图谱 基因或标记的排序与物理距离 42 4 重组率的计算重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发生交换的频率 交换频率越高 则重组型配子的比例越大 重组型配子数重组率 100 总配子数重组率用于估计交换率 但并不完全等于交换率只有发生奇数次交换 重组率才等于交换率 43 重组型配子最大可能的比例是50 这时在所有减数分裂的细胞中 在两对基因的连锁区段上都发生交换 相当于这两对基因间无连锁 表现为独立遗传 重组率的高低取决于交换的频率 而两对基因之间的交换频率取决于它们之间的直线距离 重组率的值变化于完全连锁时的0 到完全独立时的50 之间 因此重组率可用来表示基因间的遗传图距 图距单位用厘摩 centi Morgan cM 表示 1cM的大小大致符合1 的重组率 44 5 图谱制作的统计学原理 一 两点测验如果两个基因于同一染色体上且相距较近 则在分离后代中通常表现为连锁遗传 对两个基因座之间的连锁关系进行检测 称为两点测验了解各等位基因分离是否符合孟德尔分离比例 这是连锁检验的前提 在显性条件下 F2群体中分离比例为3 1 45 二 多点测验对多个座位进行联合分析 利用多个座位间的共分离信息来确定它们的排列顺序 也就是多点测验 在一条染色体上 经过多次多点测验 就能确定出最佳的基因排列顺序 并估计出相邻基因间的遗传图距 从而构建出相应的连锁图 46 6 构建DNA标记图谱的计算机软件许多学者为构建遗传图谱设计了专用程序包 通过网址http linkage rockefeller edu soft list html可以获得各种专用程序的相关信息 应用于植物遗传连锁分析和遗传图谱构建的常用软件是MAPMAKER EXP等 MAPMAKER EXP可通过ftp ftp genome wi mit edu distri bution software mapmaker3获得 该软件可以应用于各种类型的实验群体进行遗传作图 是目前应用最为广泛的作图软件之一 47 7 DNA标记连锁图谱的完善 DNA标记连锁群的染色体定位把分子标记所建立的连锁群与经典遗传图谱联系起来 并将其归属到相应的染色体上 是构建了一个比较饱和的分子图谱之后十分重要的工作 通常根据分子标记与已知染色体位置的形态标记的连锁关系来确定分子标记连锁群属于哪条染色体 48 8 遗传图距与物理距离对应关系的估计不同生物的1cM图距所对应的实际物理距离 碱基对数量 存在很大差异 一般而言 生物越低等或越简单 1cM图距平均对应的碱基对数量就越少 49 分子标记实例1遗传图绘制 亲本基因型 50 遗传图绘制 F2基因型分析 51 52 遗传图的偏离 大量的细胞遗传学研究表明 染色体的各个区段交换频率有很大的差别 近端粒区和远着丝粒区有较高的重组率 染色体的某些位点之间比其他位点之间有更高的交换频率 被称为重组热点 recombinationhotpoint 性别也能引起重组率的差异 一般而言 由女性减数分裂事件绘制的遗传图比男性的要长的多 53 部分连锁与遗传作图 构建遗传图谱的基本原理是真核生物遗传过程中会发生减数分裂 此过程中染色体要进行重组和交换 这种重组和交换的概率会随着染色体上任意两点间相对距离的远近而发生相应的变化 根据概率大小 人们就可以推断出同一条染色体上两点间的相对距离和位置关系 正因为如此 我们得到的这张图谱也就只能显示标记之间的相对距离 我们称这一距离 概率 为遗传距离 cM 由此构建的图谱也称为遗传图谱 54 基因与分子标记的共分离 共分离 如果多态性在基因组中自由发生 则有些会在特定基因附近产生 我们可以确定这样的标记 因为该标记与突变表型密切相关如果比较患病者的和正常人的DNA限制图谱 可能发现一个特定的限制性位点通常出现 或者丢失 在患者DNA中 原因是限制性标记与表型间100 相关 它暗示限制性标记与突变基因距离很紧 以至于它们在重组中不能分离 55 物理图谱 56 物理图谱 遗传图谱所表现的是通过连锁分析确定的各基因间的相对位置物理图则表现染色体上每个DNA片段的实际顺序 指DNA序列上两点间的实际距离用于确定各遗传标记间的物理距离有两种物理图谱 1 以已定位的DNA序列标记位点 STS 为位标 以DNA实际长度为图谱距离的基因组图谱 2 由YAC和 或细菌人工染色体 BAC 连续克隆重叠群组成的物理图谱 57 物理作图的概念以及简介 为什么需要物理作图技术 为什么不能直接从遗传作图进入测序阶段呢 主要有两个原因 A 遗传图谱分辨率有限 由于人类及其大多数高等真核生物来说 不可能获得巨大数量的后代 因此可用于研究的减数分裂体就少很多 连锁分析就受限制 导致标记密度的减小 从而影响遗传作图 B 遗传图谱精确度有限 1992年 酿酒酵母三号染色体全序列发表 人们对比遗传作图和DNA测序所显示的标记的实际位置 发现重组热点的存在对遗传作图的影响 在遗传图谱中甚至出现一对基因的顺序被颠倒的情况 58 Physicalmapping 为什么要进行物理作图 遗传学图谱分辨率有限遗传学图的分辨率依赖于得到的交换的数目 对于人类与大多数真核生物来说 巨大数量的后代不易获得 遗传学图谱精确度有限重组热点的存在对遗传作图的影响 酿酒酵母chr3遗传图与物理图的比较 59 Physicalmapping 结构基因组学的发展 遗传作图物理作图基因组测序 60 物理作图的方法 1 限制酶作图2 克隆作图3 荧光原位杂交4 序列标签位点作图 61 物理作图的主要环节 62 物理作图的主要方法 限制性作图 restrictionenzymemapping 克隆作图 Cloningmapping 荧光原位杂交 fluorescenthybridization FISH 序列标签位点 STS 作图 SequenceTaggedSitesmapping 63 限制性作图定义 将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置 局限性 只能应用于相对较小的DNA分子 3Physicalmapping 3 2限制酶作图 64 荧光原位杂交 fluorescentinsituhybridization FISH 65 66 67 68 69 遗传图与物理图的整合 有些标记既是遗传标记 又是物理标记 如RFLP标记 SSR标记和某些基因序列借助这些标记可以将遗传图和物理图整合起来 70 基因组测序策略 有了高密度的基因组图谱 就可以开始全基因组测序了测序的技术飞速发展 现在可以全自动化测序的策略有两个 鸟枪法克隆重叠群法 71 采集5个自愿者的DNA样品 构建3种不同插入子大小的基因组文库2Kb 10Kb和50Kb 完成约2700万次插入子末端测序 总长14800Mb GeneBank下载104018个BAC末端顺序 PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序 共4443 3Mb 随机测序与序列组装方法和指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装 72 国际人类基因组测序策略构建BAC克隆 限制性酶处理获得指纹 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 根据STS标记 将BAC克隆重叠群标定在物理图上 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序 组装 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比 将已阅读的顺序锚定到物理图上 73 克隆重叠群法 clonecontig 将基因组DNA切割长度为0 1Mb 1Mb的大片段 克隆到YAC或BAC载体上然后再进行亚克隆 分别测定单个亚克隆的序列再装配 连接成连续的DNA分子 这是一种自上而下的测序策略clone by clonemethod 74 3 序列图谱 分子水平的物理图谱 以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱 既包括可转录序列 也包括非转录序列 是转录序列 调节序列和功能未知序列的总和 测定序列 75 3 基因组测序与序列组装 基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完整的DNA顺序 最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行有机整合 以便于确定基因以及其他重要的序列在DNA顺序中的位置 这里主要介绍基因组测序中所采用的技术和策略 主要内容 1 DNA测序的方法2 DNA顺序的组装 76 77 DNA测序的方法 DNA测序技术主要有两种方法 都是在20世纪70年代中期发明的 A 链终止法 thechainterminationmethod 是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序 B 化学降解法 chemicaldegradationmethod 是将双链DNA分子用化学试剂处理 产生切口 用同位素标记进行测序 78 DNA顺序的组装 主要有两种方法将大量短的DNA顺序组装起来 鸟枪法及克隆重叠群法 79 鸟枪法和重叠群法 基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序 在此基础上再对所获得的序列进行解读 获得基因组顺序的主要方法是进行DNA测序 然后再将读取的顺序组装 目前的DNA测序每次反应仅能读取不到1000bp的长度 已知最小的细菌基因组为580kb 因此基因组测序的第一步是构建基因组图 然后将基因组区段分解逐个测序 最后进行组装 基因组作图的基本构想是 在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记 根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位 绘制基因组图 一旦构建好基因组图 即可着手进入全基因组测序 以基因组图指导的测序有2种路线 重叠群法和直接鸟枪法 80 81 什么是鸟枪法 全基因组随机测序战略主要采用鸟枪法 shotgun 鸟枪法 也俗称 霰弹法 是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序 最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装 并确定它们在基因组中的正确位置 鸟枪法 82 鸟枪法 优点 速度快 简单易行 成本较低 可以在较短的时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断 鸟枪法 缺点 最终排序结果的拼接组装比较困难 尤其在部分重复序列较高的地方难度较大 此外有许多序列片段难以定位在确切的染色体上 成为游离片断 同时又会有许多地方由于没有足够的覆盖率而形成空缺 这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的空洞 gap 也影响其准确度 83 84 重叠群法 以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用克隆步移法或称重叠群法 过程 先构建遗传图 再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库 BAC PAC等 获得精细的物理图 选择合适的BAC或PAC克隆测序 利用计算机拼装 BAC内的空洞基本上都可以利用设计引物等手段填补 形成一条完整的BAC序列 然后由相互关联 部分重叠的BAC克隆连成一个大的重叠群 Contig 理想状况下 整条染色体就是由一个完整的重叠群构成 85 但通常情况下部分BAC之间会有物理空洞 PhysicalGap 这是目前国际上还未克服的难题 利用克隆步移法测序 国际上通行的标准要求BAC测序达到十倍覆盖率 使所测的序列达到99 99 以上的