cDNA的合成实验原理和操作步骤.docx

cDNA的合成实验原理和操作步骤一、实验目的掌握植物cDNA合成的原理和方法二、实验原理反转录酶主要用于体外cDNA的合成。目前最常用的反转录酶(reverse transcriptase) 有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它们具有依赖于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子为模板，合成出一条DNA链。形成的DNA是与RNA模板互补的，因而反转录产生的DNA分子称之为cDNA。三、实验材料、器具及药品 植物总RNA溶液。 紫外分光光度计、离心机、冰盒、口罩、手套、EP管架、超净工作台、移液器、DEPC处理过的枪头、EP管等。 5M-MLV RT Buffer、 2.5mM dNTP mix 、 RNase抑制剂(30U/L)、M-MLV Reverse Transcriptase、 Oligo(dT)18 primer、无菌的DEPC水等。四、实验步骤注意：戴手套进行以下操作，严防RNase污染。1在超净工作台上吸取1ml无菌水到EP管中,加入2l植物总RNA溶液,充分混匀，在紫外分光光度计上测定260,280nm的光吸收值(OD 值),然后计算RNA的浓度,并分析其纯度。分光光度（紫外吸收）法（1）预热紫外分光光度计1020分钟。 （2）取两只比色杯，一只装入1ml H2O溶液，作为空白溶液，用来校正分光光度计零点及调整透光度至100。（3） DNA纯度及浓度测定： 取2ul DNA或RNA样品加入另一比色杯，加dH2O 至1000ul, 混匀。 将两只比色杯置分光度计中，调入射光波长，分别用空白溶液调整零点（T为100，OD为0），测定待测样品液在260nm、280nm、230nm的OD值。 计算浓度：对于双链DNA 1.0 OD260=50ug/ml, 对单链RNA1.0 OD260=40ug/ml。测定纯度： v纯的RNA溶液其OD260/OD280 的比值应介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值应大于2.0。 RNA样品OD260/OD280的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染。比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍污染。 OD260/OD230的比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。 纯的DNA溶液其OD260/OD280应为 1.8，OD260/OD230应大于2.0。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。 OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。2在DEPC处理过的Ep管中加入约4g总RNA和1l 0.5g/l的 Oligo(dT)18 primer,小心混匀, 70保温5分钟,立即浸入冰水中。3按次序分别加入下列试剂：5l 5M-MLV RT Buffer2l dNTP mix(2.5mM) 1l RNase抑制剂(30U/L) 1l M-MLV Reverse Transcriptase 然后加DEPC水到25l.4