道培医院白血病的免疫治疗20100118.doc

白血病的免疫治疗研究进展童春容免疫系统的抗白血病作用在异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）得到很好的证实。allo-HSCT治疗白血病的成功除了大剂量放化疗的作用外，移植物中免疫细胞的抗白血病(GVL)作用也是主要机理之一，allo-HSCT的白血病复发率明显低于自体及同基因造血干细胞移植（auto-HSCT 或Syn-HSCT）；去除移植物中的T细胞再进行 allo-HSCT，白血病复发率明显高于未去T细胞者；allo-HSCT后白血病复发的患者再输入同一供者的T淋巴细胞可使部分患者缓解。近20多年来，随着对抗肿瘤免疫机制了解的深入，肿瘤免疫治疗又进入一新的高潮，很多免疫治疗方法已经进入临床试验，虽然仍处于探索阶段，但一些方法已经显示其良好的前景。由于白血病的检测标记较多，标本易于获取，监测治疗效果较容易，因此已经成为探索肿瘤免疫治疗的很好研究对象。一 正常免疫系统简述 正常免疫系统分为天然免疫系统和特异性免疫系统。免疫系统的功能主要是识别外来的病原及自身突变或死亡的细胞，将其清除。天然免疫系统与特异性免疫系统的区别见表1。表1（参考LD Powell& LG Baum）特点天然免疫系统特异性免疫系统反应时间数小时至数天5天表达结构性抗原刺激后形成累及的基因102-1031010-1014抗原暴露后重塑无有克隆性反应无有参与的免疫器官、组织、细胞等Mo、M、N、Eo、Ba、NK、NKT、T、DC、表皮细胞T、BMo: 单核细胞；M：巨噬细胞；N：嗜中性粒细胞；Eo: 嗜酸性粒细胞；Ba:嗜碱性粒细胞；NK：自然杀伤细胞；NKT：自然杀伤性T细胞：DC: 树突细胞（一）天然免疫细胞天然免疫细胞具有探测微生物的病原相关特征分子（PAMPs）受体，称为特征分子识别受体(PRRs) 不需要提前与其接触就可以识别它，并启动效应功能将其清除。Toll样受体家族(TLRs)是PRRs中最重要受体，在哺乳动物体内有12种TLRs，每种特异性识别不同的PAMPs。细菌脂多糖(LPS)为细菌膜的内毒素，是一种原生态的PAMP,被TLR4特异性识别。其它的PAMPs包括细菌鞭毛蛋白、脂蛋白、革兰氏阳性细菌的脂膜酸；肽聚糖及各种核酸常来自病毒，如双链RNA(dsRNA) 或未甲基化的CpGDNA也为PAMPs。1 吞噬细胞 吞噬主要包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞，树突细胞。中性粒细胞及巨噬细胞一般没有抗肿瘤作用，肿瘤细胞一般缺乏激活这些免疫细胞的危险信号，但细菌或其它微生物可激活这些天然免疫细胞。吞噬细胞被激活后除了杀伤病原或靶细胞外，还可向病原或靶细胞所在的组织释放杀菌或抑菌分子及细胞因子，如溶菌酶、乳铁蛋白、过氧化酶(MPO)、抗微生物多肽、一氧化氮、超氧化物自由基、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、白介素(IL)、趋化因子等，这些分子在杀伤病原的同时可启动局部的炎症反应，包括血管扩张、内皮细胞激活、使更多的天然免疫细胞及T、B细胞聚集到抗原部位，使细胞成熟为有功能的抗原递呈细胞(APC)，从而激活抗原特异性T、B细胞反应。抗原递呈细胞(APC)包括各种吞噬细胞、树突细胞(DC)等，DC是功能最强的APC。 因此天然免疫系统和特异性免疫系统有密切的关系。2. NK细胞NK细胞是CD3-/CD56+细胞，占血液淋巴细胞的10%-15%，来源于骨髓的CD34+造血干细胞，是天然免疫系统的关键细胞，其发育需要IL15。根据CD56表达的强度可将NK细胞分为CD56dim及CD56brightNK细胞，前者占血液NK细胞的80-90%，具有强的细胞毒活性；后者激活后产生多种细胞因子及趋化因子，如IFN、TNF、GM-CSF、IL10等加强免疫反应。CD56dimNK细胞溶解靶细胞至少通过3个途径：释放颗粒酶和穿孔素；细胞因子如IFN、TNF、GM-CSF等诱导Fas配体（FasL）及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；通过CD16分子(FcRIII受体)介导抗体依赖的细胞毒活性(ADCC)。目前认为CD56brightNK细胞是更早期的NK细胞，而CD56dimNK细胞是终末期的效应NK细胞。Nguyen S等（2009 ）比较了11例接受部分去T细胞（pTCD）及10例完全去T细胞（eTCD ）半相合allo-HSCT后的NK 细胞；接受pTCD患者的疗效比eTCD的好，前者的CD3-CD56bright及 NKG2A+ NK 细胞及对患者白血病原始细胞的细胞毒活性比后者明显低，提示T细胞对NK细胞的分化起关键作用。NK细胞表面的一些受体可以识别非己的分子，快速启动抗病毒及抗肿瘤反应。 NK细胞接触靶细胞是否能被激活是激活及抑制性信号综合作用的结果。NK细胞主要通过三类受体识别靶细胞：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、C型植物血凝素受体（CTLR）、自然细胞毒受体(NKRs)。这些受体的功能很复杂，不同的KIR的配体是不同位点的MHC分子，已证实有15种KIRs，其配体是MHC-I类分子。KIR是一种跨膜蛋白，部分在胞浆内，胞浆内长的KIR 称为KIRL，为抑制性受体；胞浆内短的KIR为刺激性受体，称为KIRS。一般来说，每个NK细胞都表达MHC-I类分子及某种KIR，当靶细胞上缺乏KIR的MHC分子配体时， NK细胞被激活从而杀伤靶细胞。 CTLR的共同亚单位是CD94，其配体是NKG2A、NKG2C、NKG2E、NKG2F；NKG2D也是CTLR的配体，但不是CD94的配体； CD94/NKG2A为抑制性信号，调节CD8+细胞的抗病毒反应；其它 CTLR几乎均为激活性受体，与配体结合后介导对靶细胞的杀伤；NKG2D 也是一种激活性配体，在NK、 T及CD8+ T细胞上都有表达，当病毒或恶性靶细胞表达MHC相关的热休克蛋白(MIC)时，NKG2D识别该分子从而杀伤靶细胞。一些恶性肿瘤细胞可以通过下调NKG2D或释放可溶性UL16结合蛋白(ULBP)来逃避NK细胞的杀伤。NKR有三种，NKp46、NKp30仅在NK细胞上表达，NKp44在 NK及 T细胞上经IL2激活后表达；NKR识别病毒上的血凝素或血凝素-神经氨(糖)酸苷酶后激活NK细胞杀伤靶细胞。NK细胞的抗白血病作用在allo-HSCT后得到证实。Allo-HSCT的GVL效应主要由T细胞及NK细胞介导，对去T的allo-HSCT来说， NK是GVL的主要效应细胞。 Allo-HSCT后NK细胞功能的成熟是移植后免疫重建及移植疗效的关键之一（Nguyen S等, 2009）。一些研究显示KIR与配体相合性影响半相合、HLA相合非血缘及同胞allo-HSCT的结果，特别是对AML、MDS的疗效好(Savani B N等, 2009)。Willemze R 等（2009）检测了218例CR期接受了无关供者脐带血移植(UCBT)的患者,其中AML94例，ALL 124例；HLA-A、B 或-DRB1 相合者21例，不相合者197例；结果显示KIR与配体不相合者无白血病生存率（LFS）更高； AML患者KIR-配体不相合及相合者的2年LFS率分别为73%、38% (P=0.012), 复发率分别为5 %、36% (P=0.005)。HLA 12/12 完全相合非血缘allo-HSCT移植后， KIR2DS2/ HLA-C1C2 患者的AGVHD (IIIV) 更低(P=0.027) （Ludajic K等，2009）。Sobecks RM等 (2007) 检测了60例AML接受去T细胞的HLA相合同胞allo-HSCT的供者KIR及受者HLA位点，结果显示HLA-Cw C1/C2杂合子者的生存率明显比C1纯合子及C2纯合子的低（分别为5.8、43.5月，P=0.018），复发率更高（分别为47、31%, P=0.048）；C1/C2杂合子与血小板延迟植入有关， 特别是同时表达 HLA-Bw4 患者 (P0.003)。Triplett B M等(2009)检测了59 例接受非血缘allo-HSCT的抑制性及激活性NKR；Allo-HSCT后NK细胞功能重建快者生存期更长，复发率更低；患者表达HLA-C2其供者缺乏KIR2DS1者生存率最高。Pende D等（2009）分析了21例供受者KIRs不相合半相合allo-HSCT的结果，结果显示供者来源的NK细胞在移植后具有抗白血病作用并维持至移植后期；供者KIR2DL1(+) NK 细胞具有更好的抗白血病活性，而KIR2DL2/3(+) NK细胞对HLA-C2的白血病作用较差。一般的研究显示NK细胞抗AML的作用更强。Feuchtinger T等（2009）研究了285个NK细胞克隆对儿童B-ALL的作用,结果显示79%的NK细胞克隆对表达MHC-I低水平的B-ALL原始细胞有杀伤作用， 而对表达MHC-I分子水平高的ALL细胞差；NK细胞杀伤B-ALL细胞活性主要受 CD158a, CD158b, CD158e KIRs 的影响，对不表达这三种KIR或仅表达一种KIR且没有其配体的B-ALL细胞，NK细胞克隆的杀伤性更强(P=0.0005) 。因此可选择某些患者采用供者NK细胞治疗。3. NKT细胞 NKT细胞具有T及NK细胞的标志、受体，如CD16、CD56、CD161或 NKR-P1及TCR。原型NKT又被称为恒定NKT细胞(iNKT),表达半恒定的T细胞抗原受体(TCR),特异性识别MHC-I样蛋白CD1d递呈的糖脂抗原，虽然NKT细胞表达体细胞DNA重排产生的TCR，但它与其它天然免疫细胞的PRRs相似，而且不能产生对抗原的记忆反应。 NKT细胞激活后产生Th1类（IFN、TNF）及Th2类细胞因子(IL4、IL13)，这些细胞因子可进一步影响其它免疫细胞包括NK、DC、T细胞增殖及激活，产生多种免疫反应，如免疫损伤、免疫抑制、防止损伤性自体免疫反应、抗感染、抗肿瘤作用。NKT细胞激活后的作用似乎有矛盾之处。动物研究显示，CD1d限制性NKT细胞可以分为两类， V14J18+（I型）及V14J18-（II型）NKT 细胞。II型NKT主要起到免疫抑制作用，而I型NKT有抗病毒、抗肿瘤作用，这一发现解释了NKT细胞的两面性作用。半乳糖酰基鞘氨醇 (-GalCer)是海洋中海藻类生物中提取的CD1d天然配体，与CD1d结合可激活大多数NKT细胞，且主要为I型NKT细胞。NKT细胞具有IL21的受体，IL21与IL2、IL15联合可刺激NKT细胞增殖，与-GalCer联合效果更好；IL-21 也可增强CD3/CD28 单克隆抗体对NKT的激活作用；激活后的NKT细胞比CD4+细胞产生更高水平的IL21。动物试验显示，NKT细胞的数量及功能与某些类型的癌症有关， a-GalCer刺激的NKT 细胞在体外可通过激活NK细胞及IL2杀伤或抑制肿瘤细胞的生长；在动物体内应用-GalCer可介导肿瘤的消退。4. T细胞大多数T细胞的TCR由链组成，称为 T细胞，少部分T细胞的TCR由链组成，称为T细胞。T细胞是CD3+/CD4-/CD8-细胞，主要见于胸腺、肠道、脾脏红髓、皮肤，在呼吸道、生殖道也较多见，在血液中占淋巴细胞的1-10%。T细胞是介于天然免疫系统及特异性免疫系统之间的细胞，表达NKG2D,与压力诱导的MHC-I相关分子结合后被激活。T细胞的激活需要NKG2D及TCR。越来越多的证据显示T细胞除了有抗病毒、细菌作用外，还有很强的抗多种恶性肿瘤的作用。T细胞的TCR识别微生物和肿瘤产生的非多肽磷脂抗原 (PAgs)溶解靶细胞；也可通过抗PAgs 抗体介导的ADCC效应杀伤靶细胞；T 细胞还可通过粘附分子、LFA-1、链接素、CD2 、激活性或抑制性NK受体、NKG2D识别靶细胞。在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中，除了T 细胞外， T细胞常在一些实体瘤中浸润，如肺癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、 皮肤癌等。不同部位的T细胞功能不同；血液中的T可杀伤骨髓瘤及博基特淋巴瘤；而粘膜部位的T细胞可杀伤上皮癌。人血液中的T 细胞大多数表达TCR-V9, V9V2 T更偏向于杀伤血液系统肿瘤，如骨髓瘤、淋巴瘤、红白血病、淋巴细胞白血病等。V9V2 T可用于治疗表达NKG2D的肿瘤。二磷酸盐可激活V9V2 T 细胞以释放细胞因子及趋化因子，后者通过旁观效应激活其它免疫细胞，包括诱导粒细胞趋化功能、吞噬功能的增强及 -抵御素的释放(Agrati C等, 2009)；二磷酸盐尚可增加结肠癌干细胞(CSC)对V9V2 T细胞的敏感性。（二）抗原特异性免疫细胞 特异性免疫系统主要由T、B细胞组成。抗原初次接触T、B免疫细胞时不能将其清除。当抗原接触T、B免疫细胞一段时间后，T或B细胞产生抗原特异性反应，发挥效应功能后小部分细胞形成记忆细胞，此后再次遇到该抗原，记忆细胞迅速反应扩增成效应细胞，将该抗原清除。T细胞产生的抗原特异性免疫反应主要由抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)介导，又称为细胞免疫系统；B细胞产生的抗原特异性免疫反应主要由抗体介导，又称为体液免疫系统。 T、B细胞的特异性是由其细胞抗原受体的特异性组成，随着T、B细胞接触的抗原越来越多，T、B细胞抗原受体的多态性越来越大，B细胞产生的抗原特异性抗体及T细胞产生的抗原特异性CTL也越来越多。B细胞的抗原受体(BCR)主要识别可溶性抗原及细胞膜表面结合的外来抗原,可识别很多分子结构,如折叠蛋白、多肽、脂质、碳水化合物、RNA、DNA；而TCR可探测到细胞内的抗原，从而杀伤细胞内病原及突变的恶性肿瘤细胞。1. T细胞在抗肿瘤免疫系统中，T细胞占最重要的地位，近20年来抗肿瘤免疫最大的研究进展是肿瘤免疫排斥抗原的发现，以及特异性抗肿瘤CTL激活及杀伤机制的更深入了解。 1991年Boons等首次发现了人类恶性肿瘤免疫排斥抗原（介导免疫系统对其识别的抗原）黑色素瘤的MAGE-1抗原。此后大量研究显示很多恶性肿瘤细胞具有免疫排斥抗原，这些抗原可以诱导患者产生抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)和/或抗体，一些抗原特异性CTL升高与预后良好有关（J Greiner 等，2006)。已识别的与白血病有关的免疫排斥抗原越来越来多，主要分为以下几类。（1）基因突变或融合基因的产物：一些染色体断裂，两段染色体融合产生新的融合基因，产生新的融合蛋白，是白血病特有的产物；或者是白血病基因突变产生新的蛋白。如t(9;22)导致的bcr-abl融合基因产物P210、P190，t(15;17)导致的PML-RARa基因产物等。（2）正常分化抗原过度或异常表达：如William肿瘤抗原(WT1)、蛋白酶3(PR3)、蛋白酶1(PR1)、CD33、CD19、CD20、PRAME（黑色素瘤选择表达抗原）、G250/CA9、透明质酸介导的运动受体/透明质烷介导的运动受体（RHAMM/HMMR） 、多聚核糖核苷酸转移酶1（PNPT1）, 线粒体处理的多肽酶(PMPCB)、慢性髓性白血病抗原28( CML28)、人端粒酶裂解亚单位（hTERT）；B型白血病细胞表面克隆性免疫球蛋白(Ig)、T型白血病细胞表面的克隆性T细胞抗原受体(TCR)等都被证明有一定免疫原性。（3）病毒抗原：一些白血病与病毒有关，因此病毒成分可成为白血病免疫排斥抗原，如EB病毒、人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)。（4）在HLA相合的allo-HSCT，次要组织相容性抗原(mHag)是激活异基因免疫系统的主要抗原,一些mHag仅存在于造血细胞上，利用供受者之间mHag的差异，诱导针对受者造血细胞mHag的供者CTL，既可产生GVL效应，又不引起GVHD；mHag是异基因抗原，比自身抗原的免疫原性强，疗效可能更好,因此是目前研究的热点课题。介导特异性细胞免疫反应的细胞主要包括CD4+T细胞及CD8+ T细胞。抗原特异性CTL的激活需要三个信号途径。第一信号途径是MHC-抗原多肽-TCR信号途径。很多细胞都有MHC-I类分子，肿瘤细胞内的抗原被处理成多肽后与MHC-I类分子结合，再与CD8+细胞的TCR接触后激活形成CD8+ CTL。吞噬细胞可吞噬凋亡的肿瘤细胞，然后将其处理成多肽抗原后与MHC-I类分子结合，再递呈并激活CD8+T细胞，产生CD8+CTL。MHC-II 类分子主要在职业性APC上表达，包括DC、巨噬细胞、激活的B细胞等，职业APC摄取外来抗原后，将其处理成多肽，与MHC II 类分子结合形成复合物，然后再与CD4+ T细胞的TCR接触，激活形成CD4+ CTL，CD4+CTL通过释放多种细胞因子激活CD8+CTL。T细胞的MHC与APC细胞或靶细胞的MHC分子至少有一半相同才能识别靶细胞或APC上的MHC-多肽并攻击靶细胞，因此抗原特异性CTL的功能是MHC限制性的。MHC分子有很大的多态性，MHC的不同位点与不同的多肽抗原相结合，MHC-I类分子多与8-10个碱基构成的多肽结合，如HLA-A2位点多与嗜水性多肽结合；MHC-II类分子可以和13-20碱基的多肽结合。第二信号途径是指肿瘤细胞或APC上的共刺激分子与T细胞上的配体相结合，一些分子与配体结合产生刺激效应，而另一些分子与配体结合则产生抑制效应。最常见的共刺激分子及其配体见表2。第三信号途径是指决定CD4+细胞分化发展方向的因素，处女(nave)CD4+ T细胞在不同条件下发育成不同功能的T细胞，Th1、Th2、Th17、及调节性T细胞(Treg) （见图1）。处女CD4+ T细胞发展为那种亚型与刺激的抗原种类、抗原剂量、微环境、转录因子、APC激活的时间等因素有关。如果DC表达转录因子T-bet，诱导细胞产生IFN,后者诱导CD4+细胞发展为Th1细胞。埃希氏大肠杆菌可刺激APC成熟产生IL12、IFN，后者诱导处女CD4+ T细胞发育成为Th1细胞。而牙龈卟啉单胞菌则刺激APC产生IL4，后者诱导CD4+细胞发展为Th2细胞。呼吸道的DC在表皮细胞产生的TSLP刺激下诱导Th2细胞的产生。过长时间对DC的刺激可导致DC的及IL12的耗竭，难以诱导Th1产生。低剂量抗原负载DC可诱导Th2产生，而高剂量抗原的负载则诱导 Th1产生。LPS刺激的DC分泌IL16，在TGF共同作用下可使Treg转化为 Th17。IL23也可诱导Th17的产生。T细胞的激活需要成熟的DC，不成熟的DC容易诱导产生Treg灭活自体反应性T细胞；在某些情况下，成熟DC也可诱导Treg的产生。Th1可辅助产生抗原特异性记忆性CD8+ CTL；Th2诱导体液免疫反应；Th17细胞分泌IL17，可诱导产生多种趋化因子，使多种免疫细胞聚集到炎症部位，在自身免疫性疾病的免疫损伤中起很大的作用；Treg在局部可抑制免疫反应，Treg 有高亲合力的IL2受体，与效应T细胞竞争性与IL2结合，使Treg产生IL10，从而抑制Th1及Th2的作用。CD8+细胞是细胞免疫系统的主要效应细胞，特异性CTL的TCR识别靶细胞上的MHC-多肽抗原复合体后，可以通过直接接触及释放毒性物质来杀伤靶细胞，如颗粒酶、穿孔素、IFN、TNF等。2. B细胞 B 淋巴细胞可以分化为产生免疫球蛋白的浆细胞。出生后，B细胞最初由骨髓的多能造血前体细胞产生，此后不成熟的B细胞迁移至次级淋巴器官组织如脾脏滤泡或边缘带进一步成熟，表达B细胞抗原受体(BCR), 通过血液进入淋巴结、脾脏，在抗原刺激后发展为分泌特异性抗体的浆细胞。不依赖T细胞的反应由聚合抗原（含重复抗原表位）如多聚糖引起，边缘带B细胞在此类反应起关键作用，与抗原结合后快速增殖成熟为产生低亲和力免疫球蛋白M(IgM)、IgG的浆细胞。依赖T细胞的反应主要由滤泡的成熟处女B细胞引起，当B细胞与T细胞依赖抗原（如可溶性抗原、或由局部APC递呈、或免疫复合体抗原），母细胞化， 一些细胞立即成熟为分泌低亲和力IgM的浆细胞，产生最初的抗感染微生物免疫效应；而其它B细胞在T细胞的帮助下增殖、分化。生发中心B细胞不能接触可溶性抗原， 只接触滤泡树突细胞递呈的抗原，分化成为分泌高亲和力 Ig的 浆细胞。较长期以来，B细胞的抗肿瘤未得到证实。一些肿瘤模型研究显示B细胞在启动T细胞反应、介导肿瘤排斥中起到重要作用；但另一些研究则显示B细胞可抑制CTL的抗肿瘤作用。很多证据显示肿瘤患者的B细胞可产生针对肿瘤抗原的抗体，但强烈的抗体反应很少与抗肿瘤效应相关；但在一些患者，抗体可通过抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)，或补体依赖的细胞毒效应，或封闭肿瘤细胞的生长因子受体而介导肿瘤消退。表2 最常见的共刺激分子及其配体（Manches O.等）DCT细胞信号B7家族B7-1(CD80)/B7-2(CD86)CD28激活B7-1(CD80)/B7-2(CD86)CTLA4抑制B7-H1(PDL1)/B7-DC(PDL2)?激活B7-H1(PDL1)/B7-DC(PDL2)PD1抑制B7-H2(B7h;B7PR1;ICOSL ICOS激活B7H3?激活B7H4(B7S1;B7x)?抑制TNF受体家族4-1BBL4-1BB激活CD27LCD27激活OX40LOX40激活LightLight-R激活Th1T-betIL12 IFNTh2GATA-3c-mafIL4CD4+IL6 TGFTh17RORtTGFFoxP3Treg图1：CD4+ T细胞的分化发育三、白血病逃避免疫系统攻击的机制但是大多数白血病细胞逃脱了免疫系统的攻击，可能与以下机制有关。（1）白血病患者本身免疫功能缺陷：白血病细胞可直接或通过释放多种成分抑制 T、B 淋巴细胞、Mf、NK、DC等免疫细胞功能，诱导上述免疫细胞凋亡；如白血病诱导产生调节性T细胞(Treg)、单核细胞、TGF、IL10等可抑制多种免疫细胞的功能；白血病细胞表达高水平FasL可介导免疫细胞凋亡；白血病细胞可丢失Fas， 因此CTL不能通过FasL途径介导白血病细胞凋亡；白血病来源于造血免疫系统，大量的白血病细胞浸润，使免疫细胞的数量及功能缺陷；白血病细胞不是功能完整的APC，白血病免疫排斥抗原的免疫原性弱，白血病细胞的MHC分子整体或选择性不表达或表达水平降低，表达共刺激分子的水平下降或缺失等因素，难以激活特异性免疫反应。（2）白血病细胞的抗原或免疫细胞的受体突变，使已产生的抗原特异性免疫反应无效。（3）放化疗损伤患者多种免疫细胞的数量及功能。四 各类免疫治疗策略与方法目前，免疫治疗策略与方法很多，通常很多方法互相联合以发挥更大的作用，主要包括以下几类，目前更多用多种治疗方法联合治疗。（一） 过继性免疫细胞治疗过继性免疫细胞治疗是指将自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的恶性肿瘤细胞。由于急性白血病一般需要反复化疗或造血干细胞移植治疗，再加白血病细胞在骨髓及血液浸润，免疫细胞功能往往低下，疫苗、非特异免疫刺激剂等很难在较早期应用奏效。因此过继性免疫效应细胞治疗尤其适用于急性白血病的治疗。目前用于临床治疗白血病的过继性免疫细胞治疗主要有以下几种。1供者淋巴细胞输注(DLI)治疗 DLI是指allo-HSCT后再输入同一供者的外周血淋巴细胞，是防治allo-HSCT后白血病复发的最成功方法，也是大家最熟悉的方法。 DLI治疗allo-HSCT后复发的 CML效果最好；CML分子生物学复发者在DLI治疗后几乎完全CR，细胞遗传学复发者90%可达完全细胞遗传学缓解，慢性期CML（CML-CP）者完全细胞遗传学缓解率达50-90%，而加速期或急变期CML(CML-AP/BP)的CR率仅20%左右，且疗效不持久。Kolb HJ等（2009)长期比较了DLI治疗CML复发的效果，CML复发后接受DLI治疗者的10、15年生存率是66.4%， 而未采用DLI治疗者仅为42.2%、23.8% (p=0.019)；DLI治疗的同时应用小剂量 IFNa及 GM-CSF可增加疗效。DLI治疗AML、MDS的 CR率为20-40%左右；对ALL的效果最差，一般2108/kg体重。近年越来越多用逐渐增加细胞数的方法（EDR），既可保留GVL效应，又可降低GVHD(Dazzi F等, 2000；Cesare G等，2002)。采用极低细胞量的DLI联合IFN治疗CML或幼年型慢性粒单核细胞白血病（JMML）也有效，比仅用IFN或DLI的疗效好（Posthuma EF等，2004）；DLI联合GM-CSF可增加对CML的疗效（Kolb HJ等，2009)。G-CSF动员的DLI (mDLI)可降低GVHD（Pulsipher MA等，2004）。一些研究显示去除DLI中的一些CD8+细胞可减少GVHD, 但保留GVL效应（ Giralt S等，1995；Alyea EP等，1998；Dodero A等, 2009) 。Allo-HSCT后供者成分逐渐降低者复发率增加，DLI可帮助恢复供者细胞成分，防止白血病复发（Bader P等，1999）。为了减少DLI所致的GVHD，可将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶自杀基因（herpes-simplex thymidine kinase suicide gene，TK)转移至供者淋巴细胞中，DLI后如果发生严重GVHD，用更昔洛韦使自杀基因表达可致供者淋巴细胞死亡，从而减轻GVHD。Ciceri F等（2009）报告了一份I-II 期多中心非随机单倍体造血干细胞移植临床试验结果，28例高危险性AML患者在单倍体allo-HSCT后28天输注转移了TK基因的供者淋巴细胞，输注后10例发生急性GVHD(AGVHD)，启动TK基因后GVHD都被控制；19例CR期接受移植者的3年总生存率是49%；输注TK细胞后，1例患者在166 天死于感染，无基因转移相关的急性或慢性副作用；显示了TK基因转移DLI的良好应用前景。 近年一些单位先采用非清髓性预处理行allo-HSCT（NST），以减少移植相关毒性及死亡率，再用DLI增强GVL效应，一些不能接受传统预处理方案者也可接受allo-HSCT（Marks DI等，2002)，如老年、脏器功能不好者。还有一些单位先用去T细胞的allo-HSCT，以减少allo-HSCT引起的移植物抗宿主病(GVHD)，如发生白血病细胞增加或供者成分下降，再加用DLI防治复发（William R.等，1999)。一些报告显示以下方法可增加DLI的GVL效应：联合用IL2（Fefer A等，1997）；联合IFN（Posthuma EF等，2004）和/或GM-CSF（Schmid C.等，2007；Kolb HJ等，2009)；先放疗或化疗再DLI（Colvin GA 等，2009）等。 Colvin GA 等（2009）对41例难治或复发的癌症先予100 cGy的TBI，然后输注供者细胞1 x 106-2 x 108 CD3+ 细胞/Kg体重；DLI后14/26例恶性血液病患者有效，9例为明显反应，5/13例AML 患者获得持续CR， 4/13例获得PR，全部有效者形成嵌合体。 Christoph Schmid等（2007）报告，41例AML或MDS患者在allo-HSCT后3 月后复发，复发时骨髓中位原始细胞40%,先用ID-AraC化疗,再予以DLI+GM-CSF治疗,中位追踪28月；25/34例可评估的患者在治疗后CR，复发后1、2年的OS分别为 41%， 32%。2细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）1991年，美国斯坦福大学Negrin R的研究小组用抗CD3单抗（MabCD3）、IL2、IFNg、IL1培养正常人外周血淋巴细胞（PBL），其增殖活性及体内外抗肿瘤活性比淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）及MabCD3 激活的杀伤细胞（CD3AK）强，称之为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）， CIK中抗肿瘤活性最强的是CD3+/CD56+细胞 (Lu PH等，1994)。抗CD3单抗联合IL2可部分逆转CLL损害的T细胞功能缺陷（Mauro DI等，2007）。 陆道培领导的研究小组对白血病患者自体CIK进行了一系列的研究，显示CML患者自体CIK清除Ph+白血病细胞的作用明显比LAK细胞及单纯的IL2强（童春容，1996；CR Tong，2002），患者骨髓来源的树突细胞与自体外周血淋巴细胞(PBL)共培养可增加T细胞的增值能力及对自体白血病细胞的反应能力。至2006年12月， 用自体CIK(每疗程回输细胞2108/Kg)治疗了150例经化疗或/和AHCT治疗后CR的患者，其中大部分成人及残留白血病高的儿童白血病患者在回输细胞前接受化疗；治疗后中位观察31月，CIK/DC-CIK治疗后，中高危AML患者的5年持续完全(CCR)概率为61%(n=51)， 14岁以下的儿童B-ALL患者（n=33,绝大多数都有一些预后不良因素）的5年CCR概率为80%,14岁以上B-ALL（n=23,化疗后）的5年CCR概率为62%,明显高于本单位仅接受化疗或自体造血干细胞移植的患者，对未缓解的患者疗效不好；CIK/DC-CIK可使多数残留白血病标志转阴，包括克隆性IgH、TCR基因重排、t(15;17) /PML/RAR、AML/ETO+、TEL/AML1、MLL/AF9、MLL/AF10、CBFb/MYH11+、bcr/abl+、异常免疫学标志等(童春容等，2000；张乐平等，2003；童春容等，待发表）。Arai S等（2007）报告的I/II临床试验也证实自体CIK治疗对恶性血液病的疗效；auto-HSCT前患者为复发的何杰金氏淋巴瘤（HL）、多发性骨髓瘤（MM）或AML ，9例为高危HL，4例 MM；13例在移植后第4263天接受自体CIK输注，中位CIK 细胞数为0.9108 /公斤体重 (0.22108/体重)；+ 180天时4例高危HL及3例MM未复发。 DC-CIK对格列卫治疗后长期残留的白血病标志也有效；患者或供者来源的DC-CIK对allo-HSCT后白血病复发的防治也有很好疗效，一些对DLI无效者采用DC-CIK也有效，且安全，无严重GVHD发生（Ginna G. L.等, 2006；Wang JB 等，2008；2009）。DC-CIK治疗后11/18例（61%）的早期血液学复发患者获得完全缓解，5/6例的残留白血病标志消失（Wang JB 等，2008）。3. NK细胞两份临床试验结果显示供者NK细胞输注对半相合allo-SCT后AML的防治有一定作用，且不加重GVHD（Passweg JR， 2004；Koehl U，2004）。Curti A.等 (2007)报告了NK细胞治疗AML的I-II期临床试验结果，31例高危AML患者接受了半相合allo-HSCT，其中8例供受者KIR与配体不相合者在在化疗后输注供者NK细胞，中位输注NK细胞3.6 x 106/公斤体重 ，CD3+ T 细胞1x105/公斤体重，NK细胞输注后予以IL-2治疗；NK治疗后PR患者获得CR并持续6月，2/4例进展期患者的白血病持续，1例死于细胞降低，3例CR期患者稳定（分别观察 5、3、4月）。Gentilini C.等（2007）比较了不同NK细胞在allo-HSCT的作用，对17例接受纯化的CD34细胞半相合allo-HSCT的患者，在allo-HSCT后2天输注磁珠纯化的供者NK细胞8.3x106/公斤体重，其中7例输注IL2激活的NK细胞7.2x107/公斤体重；另18例接受去CD3/CD19细胞 的半相合allo-HSCT；接受IL2激活NK细胞的患者在移植后第一个月NK及T细胞比其它患者更低 (p=100倍，持续可达6个月；NKT细胞的激活与血清IL12 p40及IFN诱导的蛋白10 有关；此外GalCer负载的DC注射后也导致CMV-CD8+ CTL增加。 NKT细胞的抗肿瘤作用机制主要与IFN有关，是通过激活APC、上调其CD40L并产生IL12， 增强NK细胞及CTL 细胞活性来杀伤肿瘤细胞；而不是直接杀伤肿瘤；NKT细胞的抗肿瘤活性还与抑制肿瘤血管形成有关。 一些学者研究了如何增强NKT细胞的抗肿瘤作用。 Morris ES 等(2005)的动物试验显示，G-CSF 及FMS-样洛氨酸激酶3配体(Flt-3L) 嵌合的细胞因子progenipoietin-1可明显扩增肝脾的NKT细胞，对-GalCer的反应增强，在allo-HSCT小鼠体内可激活DC，增强供者CD8+细胞抗宿主的细胞毒活性，改善OS,与降低GVHD、增强GVL效应；采用PEG-G-CSF延长G-CSF的作用时间可增强progenipoietin-1的GVL效应。NKT细胞具有IL21的受体，IL21与IL2、IL15联合可刺激NKT细胞的增殖，与-GalCer联合效果更好；IL-21 也可增强anti-CD3/CD28 Mab 对NKT的激活作用；激活后的NKT细胞比CD4+细胞产生更高水平的IL21。 Smyth等（2009）在试验肿瘤及自发肿瘤动物体内证明IL21可增加-GalCer扩增NKT 细胞的抗肿瘤活性，其活性与穿孔素介导的NK细胞细胞毒活性增强有关。 5. T 细胞体外培养激活血液的T 细胞，其杀伤Ph+白血病及CLL细胞明显增加。一些学者研究了如何增强T细胞的抗肿瘤作用。 T 细胞预先被磷脂抗原及IL2激活后，抗自体肿瘤活性增强。有研究采用IL-2 及磷脂抗原与患者的PBMNC培养从11/ 15例转移性肾癌体内培养扩增出血液V9V2 T细胞 ，这些细胞表达激活分子及效应/记忆细胞分子，通过TCR及NKG2D受体、穿孔素/颗粒酶途径选择性溶解自体肾癌。从一些脑胶质瘤患者的血细胞中也可激活扩增出抗肿瘤的T细胞（Bryant N. L.等, 2009）。Kobayashi H等 （2006）报告，7例晚期透明肾癌在肾切除后每周或每2周输注体外培养激活的 T细胞一次，共6-12次；治疗后3/5例 患者肿瘤的倍增时间延长，这3例患者在 T细胞治疗后血液中的 T细胞增加，对肿瘤抗原反应强。Anri 二磷酸盐可激活V9V2 T 细胞释放细胞因子及趋化因子，后者通过旁观效应激活其它免疫细胞，包括诱导粒细胞趋化功能、吞噬功能的增强及 -抵御素的释放(Agrati C等, 2009)；二磷酸盐尚可增加结肠癌干细胞(CSC)对V9V2 T细胞的敏感性。Saito等（2007）用二磷酸盐及IL-2 与骨髓瘤、淋巴瘤、白血病患者的血细胞培养诱导产生抗自体肿瘤的T细胞,而对正常细胞无影响。Takahara M等（ 2008）的研究显示，负载了抗原的DCs单独或联合二磷酸盐在体外可增加 抗原特异性CD8 CTL的扩增 。一些研究者采用IL2联合二磷酸盐治疗难治复发的淋巴瘤、前列腺癌，获得了一定效果（Wilhelm M等, 2003；D