矛尾复虾虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及它的特异性检测方法研究毕业论文.doc

矛尾复虾虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的研究摘 要：2009年8至9月间，江苏赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼大量死亡，主要病变特征为体表出血、肌肉溃疡，从矛尾复虾虎鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出优势菌，通过感染实验表明了该菌对矛尾复虾虎鱼有很强的致病性，当分离菌浓度在106至108可引起矛尾复虾虎鱼全部死亡。对分离菌进行相关的形态及理化特性等生物学特性检验，分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性，并采用PAUP4.0的最大简约法(maximum parsimony，MP)构建了基于两种基因的MP系统发生树，结果表明引起矛尾复虾虎鱼大量死亡的病原为弧菌属(Vibrio)的哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。同时基于gyrB 基因和toxR基因序列各设计了1对特异性引物，接着利用该两对引物进行PCR扩增和敏感性检测，最后进行海产品的检验，建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法。在PCR扩增中，gyrB基因引物A2B3扩增目的片段大小为为363bp，该方法最低能检测0.0046875ng/L哈氏弧菌模板DNA；toxR基因引物vh-tox-F、vh-tox-R扩增目的片段大小为为390bp，该方法最低能检测0.75ng/L哈氏弧菌模板DNA。基于哈氏弧菌的gyrB基因和toxR基因建立的PCR检测技术在对由哈氏弧菌所引起的流行病的调查具有重要意义。关键词：矛尾复虾虎鱼；哈氏弧菌；PCR；检测毕业设计（论文）外文摘要Identification and specific detection method of pathogenic Vibrio harveyi from Synechogobius hastaAbstract: In August to September 2009, outbreaks of mass mortality of pond-cultured Synechogobius hasta have occurred in some ponds of Ganyu county, Jiangsu province, and gross signs of disease exhibited haemorrhages at the body surface, ulcer of muscle. A dominate bacteria was isolated from the samples of the deep ulcerate tissues and the liver, after challenge test which proved its high pathogenicity to Synechogobius hasta, and all inoculated fish died post-injection with 0.1mL live cells (106to108CFUmL-1) per fish. The biological characteristics were examined, including morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics, the 16S rRNA and gyrB genes were sequenced and compared with that of the correlative strains, the MP phylogenetic trees based on 16S rRNA and gyrB genes were constructed using maximum parsimony (MP) infected with Vibrio harveyi. The results showed that it was Vibrio harveyi which caused a large number of complex death of Synechogobius hasta. Then a rapid and accurate polymerase chain reaction (PCR) that will detect V.harveyi were established using two pairs of specific primers designed by gyrB gene and toxR gene as well as the sensitivity of the test and the last for seafood inspection. The PCR could amplify 363 bp gene fragment from chromosomal DNA of V.harveyi based on gyrB, and detect purified chromosomal DNA at a level of as few as 0.0046875ng/L. The PCR could amplify 390bp gene fragment from chromosomal DNA of V.harveyi based on toxR, and detect purified chromosomal DNA at a level of as few as 0. 75ng/L. The PCR protocol amplifying gyrB and toxR gene fragments of the V.harveyi could be useful in the specific and rapid diagnose and investigation of the epidemiology caused by V.harveyi.Keywords: Synechogobius hasta；Vibrio harveyi；PCR；Detection目 录1 绪论.12 材料与试剂.12.1 仪器与设备.12.2 试剂与培养基.23 实验方法.23.1 病原菌的分离.23.2 人工感染实验.23.3 形态与理化特性检验.33.4 16S rRNA与gyrB基因序列测定与系统发育分析.33.5 病原哈氏弧菌特异性检测方法的研究.44 结果.54.1 分离菌的致病性.54.2 分离菌形态特征 .54.3 分离菌理化特性.54.4 16S rRNA 和gyrB基因序列与系统发育分析.64.5 基于gyrB基因的特异性检测方法.84.6 基于toxR基因的特异性检测方法 .105 讨论125.1 研究水产品中细菌性疾病的意义和必要性.125.2 水产品中要病原菌.125.3 特异性检测方法.12结论 14致谢 15参考文献.161 绪论矛尾复虾虎鱼（Synechogobius hasta）分类于鲈形目（Perciformes）、虾虎鱼科（Gobiidae）、复虾虎鱼属，俗称胖头鱼、海鲇鱼、扔巴鱼，暖温性中小型底层杂食性鱼类，耐温性和耐盐性超强。矛尾复虾虎鱼体延长，前部亚圆柱形，尾部侧扁。它的头大，略扁平状；吻中长，圆钝；口裂大，下颌微突出，齿小而细密；眼小，上侧位，眼间隔宽平；体被圆鳞，尾部鳞大；背鳍两个，相互分离；复鳍发育成吸盘状，能固定于海床上，尾鳍尖长。它的体表黄褐色，有不规则暗淡斑纹，体色随栖息环境不同有所差异；腹部色浅，性成熟期呈淡黄色，复鳍泛红。一般个体体长25cm-30 cm，尾重150g-200g，最大个体长可达50cm以上，尾重超过500g。它们为暖温性大型虾虎鱼类的一种，分布于我国渤海、东海和朝鲜、日本沿岸及河口附近泥质海区。它们以沙蚕、白虾、鼓虾和大眼蟹为主食, 亦摄食小型虾虎鱼、青鳞等仔、稚鱼1。近年来随着养殖业的发展，养殖矛尾复虾虎鱼户逐渐增多，由于多种原因的共同影响，如药物的滥用，底质逐步老化，水域生态环境日趋恶化，加上管理措施不当，使得鱼病不断爆发。病鱼表现为身体发黄发瘦，弯曲成弓形，体表有大小不一的溃烂面，肠道内化脓结节，许多内部器官也发生肉眼可见的病变2。鱼病引起的鱼的死亡率达70以上，这给养殖户带来了不可挽回的经济损失。2009年8至9月间，江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼大量死亡，主要病变特征为体表出血，肌肉溃疡。我们从矛尾复虾虎鱼中深层溃烂组织及肝脏中分离到一种优势生长菌，然后对其进行生理生化和分子学鉴定，分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性，并采用PAUP4.0的最大简约法(maximum parsimony，MP)构建了基于两种基因的MP系统发生树，结果表明引起矛尾复虾虎鱼大量死亡的病原为弧菌属(Vibrio)的哈氏弧菌(Vibrio harveyi Johnson and Shunk 1936)；同时，以哈氏弧菌gyrB基因和toxR基因设计特异性引物，进行PCR检测和敏感性试验，建立哈氏弧菌特异性分子生物学检测方法。2材料和试剂2.1 仪器与设备仪器：数码显微镜，型号为DMD5-5，生产厂家为日本尼康公司；电泳仪,型号为DYY-2C，生产厂家为北京市六一仪器；水平凝胶电泳槽,型号为DYCP-31 BN，生产厂家为北京市六一仪器厂；常规PCR扩增仪,型号为TGradient，生产厂家为德国Biometra公司;双人单面净化工作台,型号为SW-CJ-2FD，生产厂家为苏州净化;微波炉,型号为P7021TP-6，生产厂家为中国Galanz；立式压力蒸汽灭菌器筒，型号为01J203-04，生产厂家上海东亚压力容器制造有限公司；恒温摇床，型号为QYC 2102C，生产厂家为上海福玛实验设备有限公司；电子天平，型号为EL104，生产厂家为梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；冷藏冷冻箱，型号为BCD-206TDZA，生产厂家为青岛海尔股份有限公司；生化培养箱，型号为SPX-250B-Z型，生产厂家为上海博迅实业有限公司医疗设备厂；台式高速离心机，型号为TG16A-WS，生产厂家为上海卢湘离心机仪器有限公司用具：培养皿、三角烧瓶、烧杯、接种环、酒精灯、试管和试管架、移液枪（10ul、100ul、1000ul）和相应枪头、EP管、记号笔2.2 试剂与培养基2.2.1 营养琼脂杭州天和微生物试剂有限公司，250g/瓶，38g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121高压蒸气灭菌20min备用。2.2.2 血液营养琼脂在上述营养琼脂培养基灭菌并自然冷却至50左右时，无菌操作按7的量加入家兔脱纤血，混匀后倾注无菌平皿即成。2.2.3 营养肉汤杭州天和微生物试剂有限公司，250g/瓶，准确称取22g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121高压蒸气灭菌20min备用。2.2.4 细菌小量基因组DNA提取试剂盒购自上海赛百盛生物公司,内含：XN结合液、漂洗液、TE缓冲液及离心纯化柱（硅胶膜）50套。2.2.5 琼脂糖及Taq plus DNA聚合酶琼脂糖（Agrose）为USA Promega公司产品，购自华美生物工程公司；Taq plus DNA聚合酶及dNTP、Buffer购自上海生工。3 实验方法3.1 病原菌的分离取发病严重尚未死亡的矛尾复虾虎鱼，经酒精棉消毒后的病鱼肝胰组织为样品，在普通营养琼脂培养基上做划线接种分离培养（28培养48h检查）细菌，将优势生长菌落移接于普通营养琼脂斜面（28培养24h）做纯培养供检验用3。菌株编号为：S090801。3.2 人工感染实验试验用鱼选用暂养1周后的健康矛尾复虾虎鱼（购自连云港赣榆县一养殖场）。将代表菌株S090801接种于营养肉汤，28过夜培养后作为供试菌液（2.1108cfu/mL）4，10倍系列稀释调至2.1108cfu/mL、2.1107cfu/mL、2.1106cfu/mL、2.1105cfu/mL、2.1104cfu/mL，共5个稀释浓度，分别经腹腔注射感染，每种浓度接种6尾，每尾接种0.1mL；同时以注射同剂量无菌营养肉汤做对照5；均隔离养殖于试验水族箱中，每天观察试验鱼感染后的发病与死亡情况。3.3 形态与理化特性检验取纯培养菌分别移接于普通营养琼脂斜面置28培养20h，做形态特征检查；利用杭州天和生物公司所产的细菌微量生化反应管做细菌的生化特性检验，包括15种糖类利用特性及H2S、吲哚、MR、V-P试验、硝酸盐还原、OF试验、枸橼酸盐利用（Simmons）以及蔗糖利用等45种理化特性，主要参照常见细菌系统鉴定手册6进行。将菌株划线接种于普通营养琼脂平板上，28培养24h后，取单菌落接种于微量生化反应管中，28静置培养适宜时间后取出观察颜色反应。3.4 16S rRNA与gyrB基因序列测定与系统发育学分析3.4.1 PCR模板DNA的制备取供试纯培养菌株接种于LB肉汤中28培养24h，按细菌小量基因组DNA提取试剂盒（上海赛百盛生物工程有限公司产）所述方法提取DNA作为PCR模板DNA。3.4.2 16S rRNA基因序列的PCR扩增16S rRNA基因PCR扩增的两个引物分别为27F（正向引物）：5-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3（对应于E.coli 16S rRNA基因的第827个碱基位置）；1492R（反向引物）：5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3（对应于E.coli 16S rRNA基因的第14921510个碱基位置）7。在25L反应体系中含有：无菌蒸馏水18L，10PCR缓冲液2.5L，25mM MgCl2 2L, 10mM dNTP混合物0.5L，10umol/L引物各0.25l,5U/L的TaqDNA聚合酶0.25L，模板DNA2L。PCR反应条件为：95预变性3min，接着94变性1min、55复性1min、72延伸2min、30个循环，然后72温育6min。PCR扩增产物在1的琼脂糖凝胶中电泳。PCR 扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。3.4.3 gyrB 基因序列的PCR扩增 gyrB基因PCR扩增的两个引物分别为：UP1（正向引物）：5-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3；UP2r（反向引物）：5-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCNGTCAT-33。在20L反应体系中含有：无菌蒸馏水14.4L，10PCR缓冲液2L，1.5m mol/L MgCl2 1.6L，4dNTP混合物 0.4L，引物各0.2L，2.5U/L 的Taq DNA聚合酶0.2L，模板DNA 1L。PCR反应条件为：94预变性5min，接94变性1min、57复性1min、72延伸2min、30个循环，然后72温育7min。PCR扩增产物在1的琼脂糖凝胶中电泳。PCR 扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。3.4.4 16S rRNA 和gyrB 基因序列系统发育树构建对分离菌的16S rRNA 基因和gyrB 基因序列通过NCBI 的Blast 检索系统( /Blast/) 进行序列同源性分析,并使用ClustalX 软件与从GenBank 数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进行多序列比对(Multiple Alignments) 并采用PAUP4.0的最大简约法（maximum parsimony，MP）构建了基于两种基因的MP系统发生树，并通过Bootstrap 法(1000 次重复) 检验。 3.5 病原哈氏弧菌特异性检测方法的研究3.5.1基于gyrB和toxR两种基因的特异性引物设计与合成根据GeneBank上已登录的哈维氏弧菌gyrB基因和toxR基因各设计一对引物。以gyrB 基因为靶基因设计哈氏弧菌的特异性检测引物为：A2：TCT AAC TAT CCA CCG CGG；B3：AGC AAT GCC ATC TTC ACG TTC。以toxR 基因为靶基因设计哈氏弧菌的特异性检测引物vh-toxR-F：TTC TGA AGC AGC ACT CAC；vh-toxR-R：TCG ACT GGT GAA GAC TCA。两对引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3.5.2 PCR反应条件的优化PCR反应主要受到Mg2+、dNTP、引物和退火温度的影响8。本实验主要研究了Mg2+的量分别进行了20mM、25mM、30mM三种；dNTP的量分别进行了20mM、25mM、30mM三种；引物的量分别进行了10mM、20mM二种。接着结合引物的退火温度设定梯度PCR的温度范围为50到65。利用gyrB基因特异性引物的PCR反应条件为94预变性5min、94变性1min、72延伸2min，30个循环后72温育7min。利用toxR基因特异性引物的PCR反应条件为94预变性5min、94变性30s、72延伸30s，35个循环后72温育5min。PCR产物在1的琼脂糖凝胶中电泳。寻找最适的反应体系和反应条件。3.5.3 哈氏弧菌敏感性检验哈氏弧菌基因组DNA 2倍连续稀释为：96ng/L、48ng/L、24ng/L、12ng/L、6ng/L、3ng/L、1.5ng/L、0.75ng/L、0.375ng/L、0.1875ng/L、0.09375ng/L、0.046875ng/L、0.0234375ng/L，共13个稀释倍数，按优化出的PCR最佳反应条件进行灵敏性检测，试验得出检测哈氏弧菌的最低DNA浓度。3.5.4 哈氏弧菌特异性检测方法的应用从连云港海昌南路海产品批发市场上买取螠蛏、糠虾、贝、虾、仔、蛤、螺、蚶和海水等作为样品来源，将其洗净、用酒精棉消毒，取肉剪小、碾碎。将其分别装入离心管中，先离心1分钟，接着100煮沸10分钟，-20冷冻2-3分钟，再煮沸10分钟，最后离心1分钟，就得到对应海产品的模板DNA9。接着按优化出的反应体系和反应条件进行PCR扩增和琼脂糖电泳，得到相应的条带。4 结果4.1 分离菌的致病性供试菌株（S090801）腹腔注射感染健康矛尾复虾虎鱼后，分离菌浓度在108-106的三个试验组，试验鱼在3d内全部死亡，分离菌浓度在105的试验组，试验鱼在7d内死亡2/3，分离菌浓度在104的试验组，试验鱼无死亡。感染死亡鱼表现下颌及体表出血，注射部位肿胀出血。对照组矛尾复虾虎鱼在14d观察期内均正常；取感染死亡鱼进行细菌学检验，结果均检验并分离到大量纯一的同供试菌株（S090801）在形态及菌落特征上相似的菌落。试验证明分离菌为本次引起矛尾复虾虎鱼发生溃疡并大量死亡的病原。4.2分离菌形态特征被检矛尾复虾虎鱼溃疡组织及肝脏均分离到了菌落特征一致的大量细菌。培养24h检查，在2216E培养基上菌落直径多在1mm左右，圆形光滑、边缘整齐、透明、稍隆起、灰白色；在TCBS培养基上菌落直径多在1.2mm左右，圆形光滑、稍隆起、边缘整齐、黄色。细菌涂片经革兰氏染色，特征为革兰氏阴性、散在或成双排列、两端钝圆、大小多在0.5-1.2m1.0-2.5m的杆菌或球杆菌。4.3分离菌理化特性分离株生化反应结果见表1。该菌的生理和生化特征鉴定结果与哈维氏弧菌( V . harveyi ) 的特征基本一致。特性分离菌哈氏弧菌特性分离菌哈氏弧菌37生长+-半乳糖苷酶-氧化酶+丙二酸盐利用+接触酶+枸橼酸盐利用-+O-F试验FF醋酸盐利用+动力+酒石酸盐利用-葡萄糖：产酸+黏液酸盐利用-产气-苯丙氨酸脱氨酶乳糖-蕈糖+麦芽糖+棉子糖-甘露醇-+果糖+甘露糖+蜜二糖-蔗糖+d纤维二糖+阿拉伯糖-d甲基红-阿拉伯醇-V-P试验-木糖-葡萄糖铵+半乳糖-d尿素酶-山梨醇-H2S产生山梨糖-乙酰胺酶-卫茅醇-硝酸盐还原+赤鲜醇-吲哚-苦杏仁苷-DNA-鼠李糖-NaCl中生长：0%+糊精+1%+肌醇-3%+侧金盏花醇-6%-水杨苷-d注：“”示阳性，“”示阴性，“F”示发酵型，“d”示11%89%的菌株为阳性“”示在原文中无记载。上角标a指表中数据取自Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed（1994）。Notes: “”, positive; “”, negative; “F”, fermentative; “d”, 11%89% positive , “”, not described in primary article. “a”，the data come fromBergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed4.4 16S rRNA 和gyrB基因序列与系统发育分析分离菌（S090801）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1468bp（GenBank 登录号：HM224413）；所扩增的gyrB基因序列长度为1186bp（GenBank 登录号：HM224411）。将两种基因序列在NCBI上通过Blast进行同源性检索，结果菌株S090801的16S rRNA和gyrB基因序列均与弧菌属细菌的基因序列自然聚类。以副溶血弧菌（登录号332299）作为外围菌进行16S rRNA基因系统发育学分析，其系统发育树如图1所示；以嗜水气单胞菌（登录号AF074917）作为外围菌进行gyrB基因系统发育学分析，其系统发育树如图2所示。在图1的系统发生树中，分离菌（S090801）与哈氏弧菌、溶藻酸弧菌、副溶血弧菌、坎氏弧菌及轮虫弧菌聚为一个大分支，且自举数据值仅为54%，基于16S rRNA基因的系统发育分析未能将分离菌（S090801）与其它几种弧菌有效区分。在图2基于gyrB基因的的系统发生树中，分离菌（S090801）与哈氏弧菌聚为一个分支，且自举数据值为89%。基于两种基因的系统发育学分析表明分离菌（S090801）与哈氏弧菌亲缘关系更近。Aeromonas hydrophila (GU596499)10Vibrio harveyi (GQ180186)Vibrio harveyi (AY750578)Vibrio harveyi (AB512466)Vibrio harveyi (AY750576)Vibrio rotiferianus (FM204864)S090801Vibrio harveyi (GU262992)Vibrio alginolyticus (EU155501)Vibrio alginolyticus (FJ981888)Vibrio parahaemolyticus (FJ172044)Vibrio parahaemolyticus (FJ161313)554438Vibrio alginolyticus (EU155503)Vibrio alginolyticus (FJ981881)2742Vibrio campbellii (FM204854)Vibrio campbellii (FM204853)Vibrio campbellii (FM204856)103554Vibrio parahaemolyticus (GQ332298)Vibrio parahaemolyticus (GQ332288)Vibrio rotiferianus (FM204861)Vibrio rotiferianus (FM204863)Vibrio rotiferianus (FM204860)Vibrio parahaemolyticus (GQ332299)7 图1 分离菌16S rRNA基因序列MP系统发育树 (图中GU596499至GQ332299为菌株在GenBank的登录号, 数字为自展值).Fig1.Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences (GU596499GQ332299 were database accession numbers in GenBank, numbers above branches in tree are bootstrap values)10Aeromonas hydrophila (AF074917)Vibrio parahaemolyticus (EF064882)Vibrio parahaemolyticus (DQ316977)95Vibrio parahaemolyticus (AF007287)Vibrio parahaemolyticus (AM235735)Vibrio parahaemolyticus (DQ316981)298100Vibrio campbellii (FM202603)Vibrio alginolyticus (EF579673)Vibrio alginolyticus (FM202621)Vibrio alginolyticus (EF579672)Vibrio alginolyticus (EF579674)67308410088Vibrio campbellii (FM202605)Vibrio campbellii (FM202602)99Vibrio rotiferianus (FM202611)Vibrio rotiferianus (FM202614)Vibrio rotiferianus (FM202612)2710084Vibrio harveyi (DQ499008)Vibrio campbellii (AY946040)Vibrio campbellii (FM202600)9991Vibrio harveyi (FM202592)S090801Vibrio harveyi (DQ499007)Vibrio harveyi (GQ232761)Vibrio harveyi (FM202591)294347899957图3分离菌gyrB基因序列MP系统发育树 (图中AF074917至FM202591为菌株在GenBank的登录号, 数字为自展值). Fig2. Phylogenetic tree based on gyrB gene sequences (AF074917FM202591 were database accession numbers in GenBank, numbers above branches in tree are bootstrap values)4.5 基于gyrB基因的特异性检测方法4.5.1 gyrB基因PCR反应条件的优化基于gyrB基因分离菌最适的PCR反应条件为在20L反应体系中含有：无菌蒸馏水11.2 L，10PCR缓冲液2 L，25mmol/L MgCl2 2 L，dNTP混合物1.6 L，引物各0.5 L，5U/L的Taq DNA聚合酶0.2 L，模板DNA 2 L。PCR反应条件为：94预变性5min、94变性1min、57.5复性1min、72延伸2min，30个循环后72温育7min。分离菌利用特异性引物A2B3所扩增的gyrB基因条带长363bp，如图3。 图3 基于gyrB基因的哈氏弧菌PCR反应特异性结果M,DL2000; 1,哈氏弧菌; 2,鳗弧菌; 3,副溶血弧菌; 4,美人鱼弧菌; 5,爱德华氏菌Fig3.Specificity of PCR for detection of V. harveyi based on gyrB geneM, DL2000; 1, V. harveyi; 2, L. anguillarum; 3, V. parahaemolyticus; 4, V. damsela; 5, E. tarda4.5.2 哈氏弧菌敏感性检验设计的该对PCR引物定位在哈氏弧菌gyrB基因的片段中。并且它的产物大小在300bp到400bp之间。引物A2B3产生363bp大小的扩增子，该引物能够在最低浓度为0.0046875ng/L下检测到哈氏弧菌，如图4。图4 哈氏弧菌PCR反应灵敏性结果M, DL2000; 1-13, 不同模板DNA PCR扩增片段（模板DNA 2倍系列稀释：依次为192ng-0.046875ng）Fig4.Sensitivity of PCR for detection of V. harveyiM, DL2000; 1-13, amplified fragments of PCR (purified chromosomal DNA of V. harveyi serially diluted 2-fold from 192ng-0.046875ng)4.5.3 海产品中哈氏弧菌的检测该引物A2B3能检测到海水，仔虾，蛤，虾，螺，贝，糠虾中的哈氏弧菌，如图5。图5 哈氏弧菌海产品检测结果M,DL2000；1-9，不同的海产品特异性扩增片段（1-9依次为海水、仔虾、蛤、虾、螺、贝、糠虾、毛蚶、螠蛏）Fig7.detection of V. harveyi of sea foodM,DL2000；1-9，amplified fragments of PCR(1-9 in turn is sea water, shrimp postlarvae, clam, shrimp, snail, cowry, mysis, blood clam, razor clam)4.6 基于toxR基因的特异性检测方法的研究4.6.1 toxR基因PCR反应条件的优化基于toxR基因分离菌最适的PCR反应条件为在20L反应体系中含有：无菌蒸馏水14.4 L，10PCR缓冲液2 L，25mmol/L MgCl2 1.6 L, dNTP混合物0.4 L, 引物各0.2 L, 5U/L的Taq DNA聚合酶0.2 L，模板DNA 2 L。PCR反应条件为：94预变性5min、94变性30s、64复性30s、72延伸30s，35个循环后72温育5min。分离菌利用特异性引物vh-tox-F、vh-tox-R所扩增的toxR基因条带长390bp，如图6。 图6 基于gyrB基因的哈氏弧菌PCR反应特异性结果M,DL2000; 1,哈氏弧菌; 2,鳗弧菌; 3,副溶血弧菌; 4,美人鱼弧菌;Fig4.Specificity of PCR for detection of V. harveyi based on gyrB geneM, DL2000; 1, V. harveyi; 2, L. anguillarum; 3, V. parahaemolyticus; 4, V. damsela; 5, E. tarda4.6.2 哈氏弧菌敏感性检验 设计的该对PCR引物定位在哈氏弧菌toxR基因的片段中。并且它的产物大小在300bp到400bp之间。引物vh-tox-F、vh-tox-R扩增目的片段大小为为390bp，该方法最低能检测0.75ng/L哈氏弧菌模板DNA，如图7。图7 哈氏弧菌PCR反应灵敏性结果M, DL2000; 1-13, 不同模板DNA PCR扩增片段（模板DNA 2倍系列稀释：依次为192ng-0.375ng）Fig7.Sensitivity of PCR for detection of V. harveyiM, DL2000; 1-13, amplified fragments of PCR (purified chromosomal DNA of V. harveyi serially diluted 2-fold from 192ng-0.375ng)4.6.3 海产品中哈氏弧菌的检测该引物能检测到海产品中的哈氏弧菌。引物vh-tox-F、vh-tox-R检测到海水中存在哈氏弧菌，如图8。图8 哈氏弧菌海产品检测结果M,DL2000；1-9，不同的海产品特异性扩增片段（1-9依次为糠虾、贝、虾、蛤、海水、毛蚶、螠蛏、仔虾、螺）Fig8.Detection of V. harveyi of sea foodM,DL2000；1-9，amplified fragments of PCR(1-9 in turn is mysis,cowry,shrimp,clam,sea water,blood clam,razor clam,shrimp postlarvae,snail)5 讨论5.1 研究水产品中细菌性疾病的意义和必要性随着科技的发展，越来越多的养殖户开始科学养鱼，养殖水产品的品种也越来越多，矛尾复虾虎鱼就是其中的一种。矛尾复虾虎鱼主要分布于北太平洋西部，我国黄渤海海域分布极广。我国的初步统计海洋虾虎鱼类约有161种。成庆泰等(1987)在 “中国鱼类系统检索” 中收入了黄渤海虾虎鱼类29种。 朱元鼎等(1965)对中国虾虎鱼类的动物地理学作了初步研究与分析10。但同时海洋水产品也极其容易受到一些致病菌的侵袭，细菌性疾病是最严重的疾病，其病原种类多，流行地区广，加上海水经济动物高密度、集约化养殖的兴起，容易爆发流行病11。有些毁灭性的疾病给海洋养殖户带来很大的经济损失。其主要表表现为多种病原混合感染，高发病率，病原菌耐药性增强，防治难度大。我们除了做相关改善养殖环境、保持良好水质，加强营养、保持养殖动物体质健壮，采用疫苗、进行免疫预防等预防措施外12，我们还可以通过一些快速检测病原菌的方法，在已经发生疾病时，及时检测出病原菌，作相应治疗。本课题的研究旨在通过PCR手段进行检测，在发病前就可知道发病状况，提前预防和控制，有助于减少养殖户由此带来的经济损失。5.2 水产品中重要病原菌水产品中病原菌主要是弧菌属。气单胞菌属(Aeromonas)是一群有单鞭毛的革兰阴性杆菌，分布广泛，是水中常居菌，可引起多种冷血动物和温血动物的疾病。流行病学分析认为气单胞菌病的发生常与食用受该类细菌污染的海产品有关13。溶藻弧菌属专性嗜盐性弧菌是引起牙鲆和鳗鲡等许多名贵经济鱼类发生细菌性鱼病的致病菌之一，威胁着我国的水产养殖业发展，它的大面积发病会给发病区渔业和养殖业带来巨大的经济损失14。例外还有霍乱弧菌和副溶血弧菌也是重要病原菌。本实验分离出来的是哈氏弧菌。哈氏弧菌( Vibrio harveyi )主要引起虾及鱼类的感染发病。该菌给澳大利亚、印度、印度尼西亚、泰国、菲律宾以及台湾等亚洲国家养虾业造成巨大的经济损失15。该致病菌可引起大规模的暴发性传染病，死亡率高达80以上。在我国，哈氏弧菌曾引起山东省青岛市胶南海区网箱养鱼场花鲈(Lateolabrax japonicus)幼鱼发生暴发性传染病，死亡率达5016; 陈献稿等(2004)报道，该菌引起广东省阳江市东平镇海水养殖斜带石斑鱼发生溃疡病。哈氏弧菌作为海水养殖鱼虾类病原菌早已被确认，本次从病死矛尾复虾虎鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出该菌，通过人工感染实验，进一步证明了其致病性。同时本实验建立的通用引物菌株鉴定和特异性检测手段丰富了哈氏弧菌的快速检测方法，有一定的实用价值。5.3 特异性检测方法常规的细菌检测通常包括细菌的分离培养、染色和生化鉴定，这些常规方法通常需要24-72h才能获得较确切的结果，往往延误诊断的时间。现在随着PCR扩增技术的广泛应用，分子靶标选择范围也扩大，不仅仅是高拷贝的基因或者富集的 RNAs17都已有成功试验，比如利用PCR技术快速检测创伤弧菌18，国外研究也比较多19。16S rRNA基因由于其保守区设计多套引物可成功扩增细菌DNA ,使得16S rDNA数据库迅速扩大起来20。细菌gyrB编码 DNA促旋酶的B亚单位蛋白, 对细菌 DNA的转录和复制很重要。该基因由Yamamoto等1995年第一次应用于假单胞菌近缘种的鉴别。Venkateswaran等通过对 1258bp的gyrB基因序列分析发现，副溶血弧菌与溶藻弧菌的 16S rDNA的相似率为 99.7%，而gyrB的相似率仅为 86.8%，可以明显区分出这两种致病菌21。而通过gyrB基因上的特定序列设计特定的引物进行PCR扩增，能够快速高效的检测出水产品中的特定细菌，此技术具有高通量、高密度、特异性、敏感性高的优点，对微生物检测方法起到革新作用22，可以在较短时间内为患者的诊疗提供指导信息，为临床合理用药提供依据。该方法适应了水产品工业和贸易迅速发展的需要，具有较高的实用和推广价值，已经得到成功应用。结 论本课题通过对矛尾复虾虎鱼毁灭性疾病致病菌的生物学特性研究表明：分离菌为弧菌属(Vibrio)的哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。该菌呈革兰氏染色阴性、两端钝圆(极个别菌体一端或两端稍尖) 、散在 (个别的成双排列) 、大小多在0.6-1.0m1.2-2.0m的杆菌(个别菌体稍弯曲) ,有的菌体呈球杆状或近似球状。 从病鱼中分离到的细菌对健康矛尾复虾虎鱼进行人工腹腔注射感染实验，发现其发病症状与病鱼相同，均表现为体表出血，肌肉溃疡。该菌的生理和生化特征鉴定结果与哈维氏弧菌( V . harveyi ) 的特征最相近。分离菌（S090801）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1468bp（GenBank登录号：HM224413）；所扩增的gyrB基因序列长度为1186bp（GenBank登录号：HM224411）。将2 株菌的16S rRNA 基因序列在GenBank上通过Blast 进行同源性检索，结果2株菌的16S rRNA基因序列均与弧菌属细菌的16S rRNA 基因序列自然聚类，在检索出的序列中, 16S rRNA 基因序列与其他弧菌的相似性均在99 %以上。另外，用分离株的gyrB基因序列进行同源性检索后，结果供试菌的gyrB基因序列与弧菌属细菌的gyrB基因序列自然聚类。在检索出的序列中，与哈氏弧菌聚为一个分支，且自举数据值为89%，这个差异远大于16S rRNA基因。因此在确定菌种时，gyrB基因因其具有较高的替换率, 并且作为蛋白编码基因所固有的遗传密码子的兼并性使其DNA 序列可发生较多替换而不改变氨基酸序列(尤其是第三位核苷酸) , 因此特别适合亲缘关系较近的菌种的区别和鉴定。 本实验在鉴定完菌种以后，亦对哈氏弧菌快速检测手段进行了研究。选择合适的用于扩增检测的基因是保证PCR方法特异性的关键。本试验基于哈氏弧菌gyrB基因和toxR设计了两对特异性引物A2B3和vh-tox-F、vh-tox-R，分别扩增出大小为363bp和390bp的条带；在此基础上分别能检测到0.0046875ng/L和0.75ng/L哈氏弧菌模板DNA。 在海产品检测中，特异性引物A2B3的扩增反应中能够检测出海水，仔虾，蛤，虾，螺，贝，糠虾中均存在哈氏弧菌，引物vh-tox-F、vh-tox-R的扩增反应可以检测出糠虾中含有哈氏弧菌。将这种特异性检测方法应用于实际检测中，简便快捷。每一批样品从样品准备到检出只需要5h，如将增菌时间计算其中，也只需要24h，比常规培养法节约很多时间，能更好的应用于实际。袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿