微生物检验培养基.doc

第十一章培养基本章考点：1.培养基的组成成分（1）营养物质（2）凝固物质（3）抑制剂和指示剂2.培养基的种类（1）基础培养基（2）营养培养基（3）鉴别培养基（4）选择培养基（5）特殊培养基3.分离培养基的选择（1）血平板（2）巧克力血平板（3）中国蓝平板或伊红美蓝平板（4）麦康凯平板（5）SS平板（6）碱性琼脂或TCBS琼脂（7）血液增菌培养基（8）营养肉汤培养基是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。一、培养基的组成成分（一）营养物质尽管不同的细菌对营养的要求不同，但细菌需要的营养物质应含有水、氮源、碳源、无机盐类和生长因子等，常用的营养物质如下：1.蛋白胨：蛋白胨是制备培养基时最常用的成分之一，提供细菌生长繁殖所需要的氮源。是动物或植物蛋白质经酶或酸碱分解而成。植物胨和动物胨各有优点，配制培养基常将两者按一定比例混合使用，提高培养基的营养价值。蛋白胨易溶于水，遇酸不沉淀，不因受高温而凝固，并为两性电解质有缓冲作用。但吸水性强，应注意干燥密封保存。2.肉浸液：是用新鲜牛肉浸泡、煮沸而制成的肉汁。其中含有可溶性含氮浸出物（肌酸、黄嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤核苷酸、谷氨酸、甘氨酸等）和非含氮浸出物（肝糖、乳酸、琥珀酸、磷酸己糖、脂肪、无机盐类等）。还有一些生长因子。肉浸液可为细菌提供氮源和碳源，但肉浸液中所含氮物质过少而不能满足细菌的需要，因此在制备培养基时应再加入l2的蛋白胨和0.5氯化钠。3.牛肉膏：由肉浸液经长时间加热浓缩而制成。糖类在加热过程中被破坏，所以其营养价值低于肉浸液，但因无糖可用作肠道杆菌鉴别培养基的基础成分。由于使用方便，常用于制备培养基。4.糖类、醇类：为细菌生长提供碳源和能源。制备培养基所用的糖类、醇类有多种，常用的糖类有单糖（葡萄糖、阿拉伯糖等）、双糖（乳糖、蔗糖等）和多糖（淀粉、菊糖等）；常用的醇类有甘露醇、卫茅醇等。除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。5.血液：血液中既含有蛋白质、多种氨基酸、糖类、无机盐类等营养物质，又能提供辅酶（如V因子）、血红素（X因子）等特殊生长因子，所以培养基中加入血液用于培养营养要求较高的细菌。另外，还可根据细菌在血液培养基中的溶血现象而进行鉴定。6.无机盐类：提供细菌生长的各种元素，如：钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等。用于制备培养基的无机盐类有多种，其中最常用的有氯化钠和磷酸盐，前者对维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压非常重要，后者是细菌良好的磷源，并在培养基中具有缓冲作用。7.鸡蛋和动物血清：虽然不是构成培养基的基本成分，但却是某些细菌生长所必需的营养物质，所以仅用于制备一些特殊的培养基，这些细菌直接从鸡蛋和动物血清中获取营养。如培养结核分枝杆菌的鸡蛋培养基和培养白喉杆菌的吕氏血清培养基等。8.生长因子：是细菌生长所必需的，但需要量很小。在制备培养基时，常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和含血液培养基中加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。（二）凝固物质制备固体培养基时，需要在液体中加入凝固物质。最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。琼脂是从石花菜中提取出来的一种半乳糖胶，当温度达98以上时可溶于水，在45以下则凝固成凝胶状态，是一种理想的固体培养基赋形剂。因其不被细菌分解利用，故无营养作用。（三）抑制剂和指示剂在制备培养基时常加入抑制剂和指示剂，这些并不是细菌生长繁殖所必需的物质，而是由于选择、鉴定及判断结果的需要。1.抑制剂：抑制剂必须具有选择抑制作用，在制备培养基时加入一定种类的抑制剂，目的在于抑制非检出菌（非病原菌）的生长，以利于检出菌（病原菌）的生长。抑制剂的种类很多，可根据不同的目的选用不同的抑制剂。常用的有胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。2.指示剂：在培养基中加入一定种类的指示剂，是为了便于观察细菌是否利用和分解培养基中的糖、醇类。常用的有酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国蓝等酸碱指示剂。美蓝常用作氧化还原指示剂。二、培养基种类（一）按培养基的用途分类培养基的种类作用举例基础培养基基础培养基广泛用于细菌的增菌、检验，也是制备其他培养基的基础成分。普通肉汤，普通琼脂平板营养培养基供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长血琼脂平板、巧克力血平板鉴别培养基利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-美蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基选择培养基在培养基中加入抑制剂，去抑制标本中的杂菌生长，有助于对所选择的细菌种类的生长。培养肠道致病菌的SS琼脂厌氧培养基培养专性厌氧菌的培养基疱肉培养基、琉基乙醇酸钠培养基细菌L型培养基针对细胞壁缺损的细菌L型采用高渗（35NaCl、1020蔗糖或7聚乙烯吡咯烷酮等）低琼脂培养基（二）按培养基的性状分类培养基种类作用举例液体培养基常用于增菌培养，也用于接种纯菌观察其生长表现肉汤培养基半固体培养基多用于观察细菌的动力，保存菌种液体培养基中加入0.30.5%琼脂固体培养基用于微生物的分离纯化、鉴定及药敏试验液体培养基中加入1.52.0%琼脂三、分离培养基的选择临床标本送往细菌实验室后，应立即接种到适当的分离培养基上。依据卫生部临床检验中心推荐，细菌实验室应备有如下分离培养基：（一）血平板适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。（二）巧克力血平板其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。（三）中国蓝平板或伊红美蓝平板可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进革兰阴性细菌生长，是较好的弱选择性培养基。发酵型革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同，在此平板上菌落颜色不同，便于鉴别菌种。（四）麦康凯平板具中等强度选择性，抑菌力略强，有少数革兰阴性菌不生长。在麦康凯平板上能否生长，是非发酵菌鉴定的一个依据。（五）SS琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。（六）碱性琼脂或TCBS琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。（七）血液增菌培养基用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。（八）营养肉汤用于标本及各类细菌的增菌。根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。如痰标本一般选用血平板、中国蓝/麦康凯、巧克力平板作分离。其中血平板用于肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离；中国蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌；而含杆菌肽的巧克力平板用于筛选嗜血杆菌等，以期提高细菌检验的准确性。本章练习题：液体培养基主要用于A.鉴别菌种B.观察细菌的运动能力C.观察细菌的菌落形态D.增菌E.抑制杂菌生长答疑编号500735110101正确答案D斜面固体培养基主要用于A.观察细菌的黏附能力B.观察细菌的运动能力C.观察细菌的菌落形态D.动力和短期保存菌种E.抑制杂菌生长答疑编号500735110102正确答案D第十二章细菌的培养与分离技术本章考点：1.基本条件 （1）细菌实验室（2）无菌实验室（3）基本设备和器具2.细菌的接种与分离技术 （1）平板划线分离法（2）斜面接种法（3）液体接种法（4）穿刺接种法（5）倾注平板法（6）涂布接种法3.细菌培养的方法 （1）需氧培养法（2）二氧化碳培养法（3）厌氧培养法4.细菌的生长现象 （1）分离培养基上菌落的生长现象（2）细菌在液体培养基中的生长现象（3）细菌在半固体培养基中的生长现象5.细菌L型的检查（1）标本采集（2）培养方法细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。细菌经培养或分离培养后观察其生长现象，对初步识别细菌的属性很重要。一、基本条件（一）细菌实验室细菌实验室是进行细菌学实验的场所。标本的接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。所以细菌室应该符合一定的条件。1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。 2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。二、细菌的接种与分离技术 接种分离法用途平板划线分离法连续划线分离法主要用于杂菌不多的标本分区划线分离法适用于杂菌量较多的标本斜面接种法要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性液体接种法（避免气溶胶的产生）多用于一些液体生化试验管的接种穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。 （一）需氧培养法本法是临床细菌室最常用的培养方法，适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板、斜面和液体培养基等，置于35温箱中孵育1824h，一般细菌可于培养基上生长，但有些难以生长的细菌需培养更长的时间才能生长。另外，有的细菌最适生长温度是2830，如鼠疫耶尔森菌，甚至在4也能生长，如李斯特菌。（二）二氧化碳培养法有些细菌初次分离培养时须置5%l0%C02环境才能生长良好，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌，牛布鲁菌等。常以下列方法供给C02。1.二氧化碳培养箱:是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。C02从钢瓶通过培养箱的C02，运送管进入培养箱内，调节好所需CO2浓度自动控制后，将接种好的培养基直接放入培养箱中培养即可。此法适于大型实验室应用。2.烛缸法:将已接种好的培养基置干燥器内，并放入点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂上凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5%l0%，然后将干燥器放入35温箱内培养。培养时间一般为1824h，少数菌种需培养37天或更长。3.化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放入干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成C02。（三）厌氧培养法适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。常用的厌氧培养法有：疱肉培养基法；焦性没食子酸法；厌氧罐法；气袋法；厌氧手套箱法。四、细菌的生长现象（一）分离培养基上菌落的生长现象1.观察菌落：菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型：（1）光滑型（S型）菌落（2）粗糙型（R型）菌落（3）粘液型（M型）菌落2.血琼脂上的溶血溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。溶血：又称完全溶血，红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环。溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。如产气荚膜梭菌。3.气味：通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，结合液体培养基上的性状，有助于细菌的鉴定。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。4.色素脂溶性色素：使菌落本身出现颜色改变。如金黄色葡萄球菌的金黄色色素。水溶性色素：使菌落周围的培养基出现颜色变化。如铜绿假单胞菌的铜绿色色素。（二）细菌在液体培养基中的生长现象浑浊生长：大多数细菌。沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对-内酰胺类和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。1.标本采集:应尽量采集无杂菌污染的组织或体液标本。胸水、腹水及尿液标本，应加20%蔗糖无菌溶液，以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。如增菌肉汤出现轻度混浊或沉淀，再分离接种于L型选择平板或血平板。2.培养方法（1）L型检查程序：将标本接种到高渗肉汤增菌培养17天，然后转种L型平板和血平板37培养27天。L型菌在L型琼脂平板上典型菌落为“荷包蛋”样，但从患