黄芪多糖的提取及分离纯化的研究.docx

广西大学硕士学位论文 黄芪多糖的提取及分离纯化的研究 姓名：赵凤春申请学位级别：硕士 专业：化学工艺 指导教师：杨克迪20070513广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究第一章绪论11引言黄芪又名绵黄芪、百本、王孙等，为豆科多年生草本植物，在全世界约有1600多种， 在我国约有130种左右，而其中药用者仅10来种，主要产于山西、甘肃、内蒙、黑龙江， 吉林等地区。主要品种有膜荚黄芪、东俄洛黄芪、毛果金翼黄芪、单蕊黄芪、无毛东俄 洛黄芪、多花黄芪等。黄芪味甘，性微温，具有补气升阳，益胃固表、托疮生肌、保护 肝脏等功效【1-Sl，黄芪在动物饲料中也有广泛应用，具有提高动物生产性能、增强机体 免疫功能和抗病力等多方面的作用。目前临床常用制剂有：黄芪多糖冲剂、黄芪多糖注射 液、黄芪注射液、黄芪水煎液和黄芪合剂等。由于黄芪药效显著，应用广泛，近年来相 关研究报道很多，目前已经从黄芪中分离出单糖、多糖、皂苷、异黄酮、蛋白质、维生 素P，氨基酸、微量元素、酚性化合物等物质，这些活性成分均与其药效相关14j，现代药 理研究证明【5】，黄芪多糖、黄芪甲苷和黄芪异黄酮是黄芪的主要药效成分。本论文主要 研究黄芪多糖。黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides,APS)是由不同单糖组成的杂多糖，相对分子质 量在1000050000左右，常温下为白色固体。黄芪多糖是一种水溶性多糖，常用热水回 流的方法提取。提取液中活性成分低，杂质多，所以必须对得到的黄芪多糖进行纯化。 目前，黄芪多糖的纯化主要采用有机溶剂分级沉淀法和凝胶柱层析法，这些方法存在有 效成分损失率高，杂质去除率低、周期长、成本高等突出缺点。为改进黄芪多糖的提取 纯化工艺，本研究拟采用大孔吸附树脂改善产品纯度，以期提高产品收率，降低成本。111黄芪多糖药理研究 黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，具有广泛的生物活性，在医学和兽医临床上研究应用也较广泛，可作为免疫促进剂或调节剂。大量体内外实验及临床研究表明，黄 芪多糖具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗应激、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、 抗氧化等多种药理功效16】，主要表现在以下几个方面：1黄芪多糖对免疫系统的作用 对免疫器官的影响，免疫器官的发育状况会直接影响机体免疫力的高低。黄芪多糖对动物机体免疫器官的促进作用，主要体现在对动物胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官重 量的增加及对创伤动物免疫器官重量减轻的拮抗作用【7J。贺生中等Is报道腹腔注射黄芪 多糖能对抗免疫抑制剂泼尼松龙、强的松龙或环磷酞胺对脾、胸腺、肠淋巴结等免疫器 官所造成的萎缩作用。光镜下观察腹腔注射黄芪多糖后小鼠的脾脏增大、淋巴结增多； 电镜下观察，浆细胞大量增生，细胞核内染色质凝集成块，胞浆内有大量不同程度扩张 的粗面内质网，腔内充满中等或低电子密度的抗体蛋白质。这种现象为黄芪多糖促进体广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究液免疫功能提供了形态学依据191。对免疫细胞和体液的影响，黄芪多糖能显著提高机体细胞免疫和体液免疫的能力。 沈美玲等11o】研究发现黄芪多糖能使小鼠脾脏增大、胸腺缩小、脾脏中thy-1阳性细胞数量 显著降低。无论在体内还是体外，黄芪多糖能降低脾细胞对刀豆蛋白和植物血凝素的应 答反应。黄芪多糖能增加机体的抗体形成细胞数。张艳等【l卜埘应用小鼠烧伤模型，对黄 芪多糖的免疫增强作用进行了研究，结果表明体内应用黄芪多糖可明显提高烧伤小鼠T 淋巴细胞的转化。黄芪多糖对烧伤小鼠的免疫调节作用依赖于巨噬细胞，通过刺激其分泌，1、抑错rPCE2合成，而促进-2的产生及IL-2R的表达，进而增强T淋巴细胞增殖。 黄芪多糖100mgkg腹腔注射6天可增加正常小鼠脾脏重量，而对胸腺与抗胸腺细胞血清 处理过的小鼠(Tx-ATS)的作用明显降低。实验表明，黄芪多糖促进抗体形成作用可能是 通过T细胞介导的【13-141。抗肿瘤作用：王光掣H】建立了黄芪多糖增强IL-2LAK抗肿瘤作用的动物模型。结果表明黄芪多糖自身具有一定的抗肿瘤作用。黄芪多糖能增强NK细胞的活性，刺激NK细 胞增殖，与IL-2合用更佳【埘。抑菌和抗病毒的作用：黄芪多糖对结核菌感染具有明显的对抗作用，对肝炎患者有明 显疗效；黄芪多糖溶液对流感病毒引起的小白鼠肺炎实变有明显的抑制作用v-20。2黄芪多糖对机体代谢的影响 双向调节血糖作用f2”，使机体的核糖核酸酶及其抑制因子平衡系统维持正常，具有保护机体的作用阎。3黄芪多糖对心血管系统的作用 对急性心肌梗死犬心的保护作用231、对急性心肌缺血的保护作用、抗心律失常的作用、抗氧化损伤作用，黄芪多糖可降低糖尿病大鼠血糖水平，对早期糖尿病大鼠内皮细 胞具有良好的保护作用【24】。另外黄芪多糖对延缓衰老和血液系统与造血系统也有促进作 用。当黄芪多糖与人参多糖配伍，可显著提高抗癌活性，降低化疗副作用，癌症患者化 疗后使用该药，能明显升高白细胞的计数。注射用黄芪多糖是目前较理想的安全有效肿 瘤用药，也可以在化学上对其进行改性使其活性增强，因而具有很好的抗艾滋病和抗凝 血的应用前景【2弛61。112黄芪多糖的化学研究 多糖是由许多单糖通过甙键连接而成的，由于单糖间连接的位置不同，多糖的结构比较复杂。组成多糖的重复单元及其连接方式对多糖的性质都有较大影响，另外，多糖 的立体结构对其性质也有很大影响，同一种单糖组成的多糖，若立体结构不同，则性质 会相差很大，因此了解多糖的组成及其立体结构对研究多糖的生物活性至关重要。目前， 对黄芪多糖的化学研究也取得定成果。黄乔书等【27】从黄芪的水提液中分离得到两种葡聚糖AG1、AG-2和两种杂多糖2广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究A111、AH2。其中AG1为水溶性的，确定为a(14)(16)葡聚糖，小(14)和ft一(16) 甙键糖基的组成比例为5：2。AG-2为水不溶性弘(1*)葡聚糖。AH1为水溶性杂多糖， 由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖以10：004：002：001组成，所含糖醛酸为半乳糖 醛酸和葡萄糖醛酸。AH-2由葡萄糖和阿拉伯糖以1：O15组成。其中AH-1和AH2具有免 疫促进作用。方圣鼎等【28】报道从内蒙黄芪的水提液中分得3种黄芪多糖：APS I、，其中APS I是杂多糖，由D葡萄糖、D半乳糖和b阿拉伯糖以175：163：1组成，分子量为36300。APSl、均为葡聚糖，主要为a(14)连接，弘(16)连接方式较少。刘星楷等嘲从膜荚黄芪中提取得到一个分子量为37500的杂多糖，其分子组成为葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比值为1：095：070，具有一定的免疫活性。邹一愚等鲫采用乙醇沉淀法将黄芪多糖分级得到两组分APS I和APS II，两者之比 为031：O69。APS I中葡萄糖含量明显低于APSII，且APS I中不含有半乳糖和阿拉伯糖， 但木糖含量很高。说明黄芪多糖中大分子量部位含有大量戊糖，而小分子量部位则以葡 糖糖和半乳糖为主。方积年等1311从蒙古黄芪的根的碱性水提液中分得一种葡聚糖，分子量为50000，由 单一葡萄糖残基组成。以1，4葡萄糖残基为主链，并在6位氧上有分枝，重复单位为10个 葡萄糖残基。Masashi Tomoda等【32】从膜荚黄芪中经十六烷基三乙基溴化胺处理并经柱层析的一 种多糖，主要由昏1，2连接鼠李糖，洳1，4连接的半乳糖及洳1，5连接的阿拉伯糖组成，分 支点位于鼠李糖和半乳糖上，属于胶类多糖。该糖对网状内皮系统有活性。Ka iimum等133】从黄芪中得到黄芪提取物(AE)，强酸性多糖部位(AEF1)和弱酸性 多糖部位(AEF2)。三个部位的主要成分均为糖，其中AEF-1可促进抗体生成，而AEF2 抑制抗体生成。史美丽例以水为溶剂，乙醇为沉淀剂，提取分离了均一性的黄芪多糖。采用凝胶层 析法测得各级分多糖的分子量，Schulz-Dinlinge：惯法求得其分子量分布曲线，结果证 明黄芪多糖主要分布在356x104540x104之间。日本学者【35弓刀对于黄芪多糖化学成分的研究主要发现了以下三种多糖，并对其中两 种的结构做了细致的研究。酸性多糖AMoa-S从蒙古黄芪中分离得到，分子量约为76000，糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，其摩尔比值约为18：18：1：1， 以洳1，5LaraB-3，6支链-D-gal为主链，并有一定的末端阿拉伯糖的存在；酸性多糖 AMemP从蒙古黄芪中分离得到，分子量为60000，糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖 和半乳糖醛酸，摩尔比为6：9：8：30，以叶1，2Lrha-a-1ADgalA为主链，并含有末端和a-1，5-L-Ara，p，l，3，p1，4，8-3，6支链D-gal以及2，4-支链-Lrha；从蒙古黄芪的根中分离 出两种杂多糖，分别为f-8和f-9，f-8的分子量为22000，糖组成为鼠李糖、核糖、岩藻糖、 阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖葡萄糖和半乳糖醛酸，其摩尔比为2：1：2：6：2：3：100：8。f-9的分子量为12000，糖组成为岩藻糖、木糖、葡萄糖和半乳糖醛酸，其摩尔比为1：2：100：8。3广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究113黄芪多糖提取及分离纯化1131黄芪多糖提取方法多糖的提取方法主要有水提取法、碱提取法、微波提取法、酶提取法381和超滤法等。1水提醇沉法：首先将黄芪切成小片，用蒸馏水浸泡过夜，水煎煮三次，每次15h， 取上清浓缩，合并上清液浓缩成l：l，浓缩液加95乙醇使最后醇浓度达60，滤去析出物， 加水溶解，离心除去不溶物。滤液继续浓缩，加乙醇沉淀，低温静置过夜，倾出上清液。 沉淀部分加高浓度乙醇搅拌，离心去乙醇，沉淀再继续用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤， 干燥得黄白色黄芪多糖粗品。称其质量并计算得率。倪艳等391研究了水煎煮法提取黄芪 多糖，用乙醇沉淀法锝到了粗多糖。最佳提取工艺为：12倍量水，提取3次，每次15h。 多糖收率为20，总多糖含量为3754。2碱溶液提取：黄芪多糖作为黄芪纤维质的组成部分，其提取收率取决于黄芪纤维 质的溶胀作用和溶解性，而纤维在碱中的溶胀作用和溶解性均显著增加。同时，在碱性 条件下纤维之间的酯键易断裂而发生剥皮反应，使更多的多糖得以游离而被提取出来， 提高多糖收率。李红民等40i比较了用水提取、氧化钙水溶液提取和碳酸钠水溶液提取法 制备黄芪粗多糖效果。实验结果表明CaO水溶液提取多糖收率最高为117，而水提法 提取多糖收率为36，Na2C03水溶液提取多糖收率为57。3微波法：近年来，微波技术发展很快，超声波是一种弹性机械振动波，它具有能 产生强烈振动、强烈的空化效应和搅拌作用、高速度等优点，因此能破坏植物药材的细 胞，使溶媒能渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解于溶媒中，故能提高 有效成分的提出率，但不会改变有效成分的结构，从而为中草药成分的提取提供了一种 快速、高效的提取新方法。应用于黄芪多糖的提取中，具体过程如下：首先，运用微波技 术将黄芪用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质，用80的乙醇提取除去所含单糖、低聚糖及 甙类等于扰性成分后，再放入MCL-3型连续微波反应器中继续以水回流提取20min调整 功率630W，600W，560W，450W，减压浓缩至一半体积，加入01活性炭、脱色，过滤， 滤液加入95乙醇溶液，静置过夜，过滤，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，即得黄芪 多糖粗品，烘干备用，最后测其得率和含量。王莉等141运用微波技术提取黄芪多糖。首 先用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质，然后用80乙醇提取除去黄芪所含的单糖、低聚糖 及甙类等干扰性成分，再运用微波技术用水提醇沉法制得黄芪粗多糖，得黄芪中多糖含 量为655。这是首次运用微波技术从黄芪中提取出多糖，反应速度较快，但微波加热 方式为由内向外，速度快，温度高，有可能导致黄芪多糖断链降解，所以该法的可行性 还待进一步探讨。4超滤法：韩鲁佳等【42l研究了从黄芪中同时得到多糖和皂甙的提取工艺。采用先醇 提后水提的方法，确定了合适的醇提次数和浓度。另外，还研究了超滤法与树脂吸附法 相结合的工艺，可以同时得到高含量的多糖和皂甙产品。具体工艺为：黄芪一醇提一水提 一真空浓缩一醇沉一真空干燥一多糖粗品。实验结果表明：(1)醇提次数增多，多糖的含4广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究量稍有提高，得率下降：以95乙醇提取两次，多糖和皂甙的得率和含量都可达到较高； (21醇提浓度越高，多糖的得率越高，但含量下降，对多糖的提取，以95乙醇提取后进 行水提效果较好；f3)超滤法所得多糖、皂甙的得率和含量都较高。水提醇沉法，多糖的 提取比较充分，皂甙的得率和含量较低。醇提水煮法则可得到较高得率和含量的皂甙， 但多糖的得率降低，含量稍有提高。综上所述可以看出，不同的工艺条件，黄芪多糖的收率及提取成本不同：(1)水提醇 沉法，多糖的提取比较充分，若用碱性溶液提取黄芪多糖可以提高收率，降低成本，在 生产应用上更具有现实意义。但由于碱性的强弱对纤维多糖的结构影响很大，所以，在 提取黄芪多糖时适合用较弱的碱。(2)黄芪多糖的收率与纯度还与提取次数及醇的浓度有 关，提取次数越多，多糖的含量稍有提高，但得率下降。醇提浓度越高。多糖的得率越 高，但含量下降。(3)多糖是极性大分子化合物，多采用不同温度的水和稀碱溶液提取， 尽量避免在酸性条件下提取。(4)微波技术应用于黄芪多糖的提取中，可使反应时间缩短12倍左右，多糖含量提高。1132黄芪多糖的分离纯化方法提取出来的粗多糖中仍然含有蛋白质、微量的色素、无机盐等杂质，影响多糖的结 构研究及药理活性研究，需要进一步分离纯化才能得到纯的多糖产品，纯化方法一般有 以下几种。1分部沉淀法【4习 根据不同多糖在不同浓度的低级醇或低级酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入这些醇或酮以分部沉淀。如首先加入的醇或酮，使其浓度为30，可将分 子量最大的部分沉淀出来，然后将浓度增加到50，可使中等分子量部分的多糖沉淀出 来，进步增加醇或酮的浓度，可使较小分子量的多糖(或寡糖)沉淀出来，这样就可依 次将不同分子量的多糖分离开来。2盐析法根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入不同盐析剂可使不同多糖逐步析出。常用的盐析剂有-NaO、KCl、(NH4)2S04等，其中以(NI-L0eS04最为常用湖3金属络合法 有的多糖能与铜、钡、钙和铅等离子形成络合物而沉淀，常用的络合剂有菲林试剂、CuCl2、Ba(OI-I)2等。得到的络合物沉淀经水充分洗涤后，用无机酸乙醇溶液或硫化氢处 理，即得游离的多糖I删4纤维索柱层析法 将多糖混合物用4倍体积的乙醇全部沉淀到惰性多孔的纤维素柱上面，然后用由高到低的不同浓度乙醇洗脱，则不同多糖就依次洗脱出来。洗脱过程中，多糖在柱上进行 无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离开来，这种方法本质上与分部沉淀相反， 可称为“分部溶解法”。其理论塔板数较高，所以流出多糖液的纯度较高。5广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究5季铵盐沉淀法 根据长链季铵盐能与酸性多糖成盐而形成水不溶性多糖化合物的特性，以分离酸性及中性多糖，常用的季铵盐是十六烷基三甲基铵的溴化物(CTAB)及其碱(CTA-OH)和十 六烷基毗啶(CPC)。实验时必须严格控制多糖混合物的pHi,于9及无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来，通常CTAB或CPC水溶液的浓度为IIO(WV)，在搅拌下滴加于O11(wv)的多糖溶液中，这时酸性多糖即能从中性多糖中沉淀出来【45】。一般酸性 强或分子量大的酸性多糖首先沉淀出来，控制季铵盐的浓度，也能分离各种不同的酸性 多糖。根据形成的沉淀能溶于不同的盐溶液、酸溶液和有机溶剂的性质，使多糖游离出 来。6纤维素阴离子交换柱层析法 常用的交换剂有DEAE(_二Z,基胺基乙基)纤维素等，此法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。在pH6时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖则不吸附，然后用 pH相同但离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分部洗脱下来，但如果柱为 碱性，则中性多糖也能吸附。另外，中性多糖还能与硼砂形成络合物，所以有时将柱处 理成硼砂型后，用不同浓度的硼砂溶液洗脱，也能将不同中性多糖分离开来，阴离子交 换柱层析是目前最常用的方法。多糖在交换剂上的吸附力与多糖结构有关，吸附力一般 随多糖分子中酸性基团的增加而增加。对于线状分子，分了量较大的多糖吸附力较强。 直链多糖比支链多糖易于吸附，对于分子量为10万左右的多糖，19样品需用1009DEAE 纤维素，洗脱方式可以是阶梯式或梯度式，还有DEAESephadex和DEAE-Sepharose等方 法，它们除了有交换吸附外，还有分子筛效应，分离效果更好。7凝胶柱层析法糖凝胶，以及性Sephacryl等m】，洗脱剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，其离子根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂强度不低于002molL。8其它方法 多糖的纯化还可用制备性高效液相层析，制各性区带电泳、超过滤和亲和层析等等，这些方法主要适合制备一些小量纯品供结构分析使用【47】。 沉淀所得的多糖常常含有较多的蛋白质，可选择使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂来除蛋白。常用脱蛋白的方法有Sewage法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法及蛋白酶水 解法等。0)Sevage法是用氯仿、正丁醇按5：1混合后，加到样品水溶液中剧烈振荡，离心除 去位于两相之间形成凝胶状的蛋白质，反复多次直到蛋白质除尽为止，此法效率不高， 但很温和，一般不会破坏糖苷键【4sl。三氟三氯乙烷法是以多糖水溶液和三氟三氯乙烷按1：l(V)混合，搅拌10min左 右，离心，取水相部分重复处理，至除尽蛋白质。此法应在低温下搅拌，由于溶剂较易 挥发，虽然效率较高，但使用起来受到限制，实际上应用较少1491。6广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究三氯乙酸法是利用三氯乙酸能沉淀蛋白质的原理，以530的三氯乙酸一正丁 醇溶液加入到等体积的多糖水溶液中，混合搅拌20min，离心除去胶状沉淀即得无蛋白 的多糖溶液。此法较为剧烈，对于含有呋喃糖残基的多糖由于连接键不稳定，容易破坏 此类多糖：而且非常容易造成硫酸多糖的硫酸根脱落，但该法效率较高，操作简便，植 物来源的多糖常采用此法【5042|。蛋白质水解酶法可以除去上述三种方法不能除去的与多糖结合在一起的蛋白质， 一般先用蛋白质水解酶使多糖溶液中的蛋白质部分降解后，再使用Sevage法效果更好【52】。比较上述黄芪多糖的提取和纯化方法，水提醇沉法是传统的多糖纯化方法；超滤法 是一项新兴的高效分离技术，能有效分离溶液中的大小分子，控制所得产品的相对分子 量分布，而且有浓缩作用，提高有效成分浓度，减少剂量。与通常的分离纯化方法相比， 超滤具有不必经过相转换、不需要添加化学试剂等优点，清洁环保，非常适于热稳定性 不好的中草药活性成分的分离纯化。114树脂吸附分离技术在多糖纯化中的应用树脂吸附法提取分离天然产物是20世纪60年代发展起来的新技术，具有选择性好、 吸附容量大、再生处理方便、吸附迅速、解吸容易等优点，己在环保、食品、医药等领 域得到了广泛的应用。大孔树脂是在凝胶树脂基础上发展起来的一种新型树脂，具有更 丰富的孔结构和更大的比表面积，吸附速度快，效率高，在天然产物精制纯化中的应用 逐年增加，呈现出良好的发展态势。树脂在多糖分离纯化中都已有应用：李全阳等【53l对酸乳中的乳酸菌胞外多糖采用蛋白酶水解、离心、乙醇沉淀进行初步 分离提取。进一步采用三氯乙酸法去除蛋白，再经过透析、超滤、DEAESepharose CL-2613 离子交换柱层析和Sepharose CL22B凝胶柱层析使多糖得到纯化。彭密军等【541采用新型大孔吸附树脂对松脂醇二葡糖苷进行吸附及洗脱性能实验。筛 选出效果较好的s8树脂，确定了最佳的工艺参数，使松脂醇二葡糖苷的含量由原材料 中的0085富集提高到385，得率达855。刘树兴等【55】研究了用大孔吸附树脂制备桑叶多糖的工艺。实验结果表明：D101树脂 吸附和分离桑叶多糖的交换容量为465mgmL湿树脂。在50、pH5时，吸附能力强。被吸附的桑叶多糖用01molL的NaoH溶液洗脱，洗脱液温度为室温，洗脱流速为06Bvfa。D101树脂非常稳定，可重复使用至少9次，吸附能力基本不变。多糖得率为087。 吴华端等【561从蜈蚣蕨中提取水溶性粗多糖，经DEAE纤维素52柱层析和葡聚糖凝胶G200柱层可得到纯品。 张林维等【571对当归多糖进行分离纯化实验，中药当归经热水提取、乙醇分级沉淀、DEAE纤维素和Sephadex G2150柱层析，得As2 IIIa和As2 lIlb两个多糖级份。7广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究12课题研究的目的和意义多糖的应用可分为两个方面：一类是利用多糖的独特理化性质，如易形成凝胶、高 渗透压、高粘度和吸水性，制备医药材料、药物缓释剂、血浆代用品等；另一类利用多 糖的抗原性、抗肿瘤、降血糖、促进免疫功能等生物功能或活性制备疫苗或新药，如从 多糖中寻找具有抗艾滋病的新药己引起人们很大的兴趣。美国学者MYalvani认为：“至今多糖在生物技术领域仍是一个沉睡的巨人，有待于大家去唤醒。”可以预言：活性多糖的研究与开发将成为生命科学中的重要课题。但是，多糖的研究毕竟起步较晚，各方 面尚需进行深入的研究，大量新的活性多糖有待于研究与开发，多糖的作用机理以及生 物功能与结构的关系的研究不断深入，而且不断有新的多糖物质被发现。黄芪多糖不仅能明显促进机体特异性免疫和非特异性免疫，提高机体的抗病力和抵 抗力，还可作为免疫增强剂与疫菌苗配合使用，显著提高疫菌苗的保护力和机体抵抗力， 而且，还能诱生干扰素，产生抗病毒、抗肿瘤作用，用于病毒性和肿瘤性疾病的预防及 治疗过程中。正因为黄芪多糖具有多种重要的药用价值，人们对它的研究和开发越来越 深入，而选择一种简便、高效、低成本的黄芪多糖提取纯化方法，对黄芪多糖的开发就 显得尤为重要。近r20年来，报道了多种提取多糖的方法，主要包括水煮醇沉法【58，439】、 微波提取法1411、超声提取法【591、超滤法删等，一般采取水煮醇沉法，因该法工艺简单 操作方便，但对它提取工艺进行优化较少。本课题针对以上情况，以黄芪多糖得率和纯 度为目标优化黄芪多糖的提取工艺，使用大孔吸附树脂对黄芪多糖进行分离纯化，确定 大孔吸附的最佳工艺条件，并且对所提多糖的单糖组成进行分析，对今后黄芪多糖结构 的进一步研究打下基础。13本论文研究的主要内容综上所述，黄芪多糖是一种有广阔开发前景的多糖。本研究试图通过对黄芪多糖的 浸提、分离、纯化工艺的优化，找到并建立一条经济合理的工艺流程，为黄芪多糖的开 发利用提供实验依据。实验内容包括以下几个方面：(1)采用水提醇沉的方法提取黄芪多糖，以多糖得率及粗多糖纯度为目标函数， 主要探讨提取温度，提取时间，固液比等因素对多糖得率和纯度的影响，用正交法确定 黄芪多糖的较佳提取工艺。在此基础上，分别探讨黄芪多糖的微波、超声辅助提取效果， 并对不同的提取方法进行比较。(2)采用大孔吸附树脂分离纯化黄芪多糖，筛选出合适的大孔吸附树脂x5，并系 统的研究它的静态吸附性能和树脂床动态吸附洗脱参数，确定大孔吸附的最佳工艺条 件，获得纯度较高的黄芪多糖。(3)将黄芪多糖酸完全水解后，运用薄层色谱分析法对黄芪多糖的单糖组成进行研究。8广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究第二章黄芪多糖的提取方法及提取条件优化21引言多糖的提取方法很多【61刁，已见有热水浸提法、碱浸提法、酸浸提法和酶浸提法等 等。根据不同性质多糖的提取而采取不同的提取方法。酸、碱浸提法对多糖的降解较为 明显，酶浸提法虽然反应较为温和，但需要找到合适的水解酶，而且一些酶价格也较为 昂贵。提取多糖采用的水提醇沉法，虽有耗醇量大、工艺时间长等不足，但可以保留较 多的有效成分，而且具有成本低廉、工艺简单等优点，目前仍被广泛采用。因此，本实 验还是采用了传统的水提醇沉法提取黄芪多糖。22实验材料、试剂和仪器221材料与试剂黄芪(批号20051 101)，购自广西南宁市一心药业公司，经分析，符合中华入民共和国药典2005年版“黄芪硕下有关规定。98硫酸、苯酚、95乙醇、葡萄糖，以上试剂均为分析纯。苯酚使用前经蒸馏处 理，收集1800c 1820(2馏分待用。222主要仪器rUV-2501PC型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；BS 124S电子分析天平(北 京赛多利斯仪器系统有限公司)；LABORTA 4000旋转蒸发器(德国Heidolph公司)； KQ500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；NJL073微波萃取器(南京杰全微波设备有限公司)；删一S型恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；SHZ-D()循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；101A-E1电热鼓风干燥箱 (上海实验仪器厂有限公司)。23实验方法231多糖提取方法2311热水浸提法选择浸提温度、浸提时间和固液比为考察因素，以多糖得率和纯度为考察指标，采 用单因素实验，再做b(34)正交试验方法，确定黄芪多糖水浸提法的最佳工艺条件。称取209黄芪粉末，加入48倍量的水，在一定温度下提取26h，抽滤、提取液适 当浓缩，加入约5倍浓缩液体积的957-,醇，静置过夜，过滤、沉淀物放入电热鼓风干 燥箱于60C干燥1小时，得到黄芪租多糖，备用。黄芪多糖(AMP)的制备流程：黄芪药材一提取一提取液一浓缩一加醇一静置过夜一过滤一沉淀物一干燥一黄芪粗多糖。9广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究2312微波辅助水浸提法选择微波功率、微波时间和固液比为考察因素，以多糖得率和纯度为考察指标进行 单因素实验。准确称取209黄芪粉末，1111K415倍量的水，在微波作用下提取一定时间，过滤得 提取液，提取液处理同水浸提法。2313超声辅助水浸提法选择超声功率、超声时间和固液比为考察因素，以多糖得率和纯度为考察指标进行 单因素实验。准确称取209黄芪粉末，加A415倍量的水，在超声波作用下提取一定时间，过滤 得提取液，提取液处理同水浸提法。232多糖含量分析方法(苯酚硫酸法)Io删。2321原理多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速分解，产生单糖，单糖在强酸性条件下与苯酚生 成橙色衍生物，该橙色衍生物在波长490rim处有最大吸收。苯酚硫酸试剂可与游离的或 寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起显色反应，己糖在490rim处(戊糖及 糖醛酸在480nm)有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。2322标准曲线的绘制精确称取葡萄糖O13569于d,烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至100mL棕色容量瓶中， 用蒸馏水定容，摇匀，得标准品溶液。准确移取该溶液05、2、35、5、65、8mL分别 置于50mL棕色容量瓶中，加蒸馏水至刻度。准确移取上述各浓度的标准溶液30mL于25mL；棕色容量瓶中，分别加入5苯酚溶液35mL，摇匀，迅速加入15mL浓硫酸，于室 温下显色15分钟，加入蒸馏水定容至刻度、摇匀，于冷水中放置30分钟。在波长490rim 下测定吸光度，同时做一空白，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准 曲线。2323样品的测定准确称取一定量的样品，用蒸馏水溶解，并定容于100mL容量瓶，摇匀，吸取样品3mL-于25mL棕色容量瓶中，按标准曲线的绘制同样操作步骤测定对应的吸光度，对照标 准曲线，即可计算租多糖的含量。24结果分析与讨论2，41苯酚硫酸法测定条件的确定2411最大吸收波长的选择取配置的标准葡萄糖溶液30mL，加入5的苯酚35mL，摇匀，迅速加入浓硫酸lO广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究15mL，室温显色15分钟，冷却。进行紫外光谱扫描，结果见图21，从图可知，吸光度最大吸收波长为490nm。Wd山T咖s巧5 Ah：13柚图21葡萄塘紫外吸收光谱Fi921 UV scanning curVe ofglucose afIer acid hydrolyzing2412显色时间的确定取标准葡萄糖溶液30mL于25mL棕色容量瓶中，加入5的苯酚35mL，摇匀，迅 速加入浓硫酸15mL，摇匀，迅速移入比色皿，记录标品吸光度随显色时间t的变化，结 果见表2-I。结果表明，体系吸光度在1060分钟内稳定，因此选用显色时间为15分钟。表21葡萄糖吸光度随时间变化Tab2一l Changeofabsorbanceforglucosewithtime2413标准曲线的绘制以葡萄糖为标准物配制葡萄糖标准溶液，显色后于波长490rim处测量吸光度。标准 曲线测定结果见表2-2，对所测数据采用回归法计算出标准曲线的回归方程为：y-47575xqo0015(R2=09985)，标准曲线图如图2-2，由标准曲线可以看出葡萄糖浓度 在00016mgml00260mgna时浓度与吸光度成线性关系。表2-2葡萄糖标准曲线的测定Tab22 Determination ofgluCOSes standard curve广西大学硕士论文黄篦多糖的提取及分离纯化研究1412108060402OOO005 0Ol o-015002 0025 003图2-2葡萄糖标准曲线Fig2-2 Standard curve ofglucose242热水浸提工艺条件的确定影响多糖提取效果的因素有浸提温度、浸提时间、料液比、浸提次数、醇沉浓度等。2421单因素实验结果及分析为了获得在各个影响因素提取效果较好的一些因素水平，使得正交实验在较好的因 素水平中进行，所以先进行各提取因素的单因素实验，然后根据单因素实验选出各因素 中比较好的水平，设计正交实验找最优方案及工艺。1、浸提时间对黄芪多糖得率和纯度的影响图2-3时间对多糖得率和纯度的影响Fig2-3 Effects ofextraction time on the yield and purity图2-3为溶剂用量为5mLg原料，90C-F，提取时间对多糖提取效果的影响。由实验广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究结果可知，萃取前期，溶液中多糖的浓度较小，黄芪药材内外多糖的浓度差较大，推动 力较大，多糖得率随时间逐渐增加，在4h左右时达到最大值，增加提取时间，多糖得率 变化不大，原因是随着提取时间的增长溶剂中多糖浓度越高，浓度差变小，扩散速度减 慢，基本达到平衡；由于黄芪中其它成分的溶出，多糖纯度反而呈下降趋势，而且时间 越长，能耗越多。综合考虑，本次实验选择提取时间为4h较为合适。2、料液比对黄芪多糖得率和纯度的影响图2_4溶剂用量对多糖得率和纯度的影响Fig2-4 Effects ofsolvant volume Oil the yield and purity图24为在90下，提取时间为4h，溶剂用量对多糖提取效果的影响。实验结果表 明，当溶剂量小于lOOmL(5mLg原料)时，溶剂用量增加有利于多糖提取，多糖从黄芪细胞到溶剂是个由浓度差推动的扩散过程，溶剂用量越多细胞内外的多糖浓度差就越大，既推动力越大，扩散到溶剂里的多糖就越多。但是，从细胞中提取多糖的过程除 了简单的扩散过程之外，还有受细胞膜影响的阻滞扩散过程，多糖的整个扩散速度是受 阻滞扩散控制的。而阻滞扩散速度取决于细胞膜结构。增加溶剂用量虽然在一定程度上 增大浓度差推动力，能促进多糖的提取，但是起决定作用的细胞膜结构并没有变化。当 溶剂用量大于lOOmL时，溶剂用量的增加对多糖得率影响不大，多糖纯度有所下降，这 就是当溶剂用量增加到一定时再增加也不会提高溶剂中多糖含量的原因。而且料液比太 高不利于以后的分离浓缩。故选用1：5为最佳料液比。3、提取温度对黄芪多糖得率和纯度的影响 图25为提取时间4h，溶剂用量为5mLg原料，提取温度对多糖提取效果的影响。由图25可知，随着提取温度上升，多糖得率和纯度呈上升趋势，当提取温度超过90 以后，多糖得率基本恒定，多糖纯度里下降趋势。这是因为温度升高，溶剂的渗透能力广西大学硕士论文 黄苠多糖的提取及分离纯化研究和溶解能力提高，分子动能增加，使多糖更有效地溶出，得率不断提高。但随着提取温 度增加(90以上)，黄芪中黄酮、皂苷类成分提取量增加，多糖颜色变化较大。传统 的水煮醇沉法提取黄芪多糖，温度一般控制在100，得到的多糖颜色呈深红色，煎煮 过程中其它有效成分也被提取出来，在多糖分离纯化后续工艺中难以将这些成分分离出 来，既影响多糖产品纯度，又造成黄芪其它活性成分丢失，因此，为提高黄芪多糖得率 和产品质量，同时尽可能地实现黄芪多糖与其它活性成分的选择性提取，本研究将提取 温度控制在90。图2-5温度对多糖得率和纯度的影响Fig2-5 Effects oftemperature Oil the yield and purity上述单因素实验结果表明，采用水浸提法提取黄芪多糖，较优的提取条件为：提取 温度为90C，提取时问为4h，溶剂用量为5mL水幢黄芪原料。24工2正交实验结果与分析本实验的目的是通过正交实验找到一个最佳的实验工艺参数，作为黄芪多糖提取的 最佳实验条件。(1)因素水平的选择 由以上的单因素实验，根据单因素实验选出各因素中比较好的水平，设计正交实验找出该提取方法的最优方案及工艺。在参考文献基础上，采用k(34)正交表设计正交 实验，选取浸提温度(A)、浸提时问(B)、料液比(c)-项作为考察因素，以黄芪多糖纯度、多糖得率为评价指标。对水提取工艺条件进行优化，。因素水平表见表23，14广西大学硕士论文黄芪多耱的提取及分离纯化研究直观分析结果：1因素影响主次：提取温度料液比提取时间2最优方案：提取温度90C，提取时间4h，料液比1：5(SmL水g黄芪原料) (3)方差分析 将正交实验结果进行方差分析，结果表25。由表中方差分析结果表明：提取温度对黄芪多糖的提取效果影响显著。表25正交实验结果方差分析表Tab2-5 Variance analysis ofOrthogonal experiments results(4)热水浸提法最佳工艺验证实验 按最优方案提取黄芪多糖，得多糖得率和纯度分别为531、5632，优于正交实验及单因素中的任何一组实验，因此可以确认该方案为最优。243微波辅助水浸提法(1)在热水浸提基础上，本实验用微波辅助对黄芪多糖提取，只进行单因素实验。1、微波时间对多糖得率和纯度的影响图2-6为微波功率300W，溶剂用量为5mLg原料，微波辅助作用时间对黄芪多糖 提取效果的影响。由结果可知，随着微波辐射时间的增加，多糖得率和纯度均显著上升，10 rain后，多糖得率和纯度均达到最大值，提取效果及选择性明显好于没有微波辅助的 水浸提效果。从实验操作与节约能源的角度考虑，微波辐射时间设定在lOmin左右为宣。图2-6微波辐射时间对多糖得率和纯度的影响Fig2-6 Effects ofmicrowave irradiation time on the yield and purity16广西大学硕士论文 黄芪多糖的提取及分离纯化研究用量太少，由于浓度差太小不利于黄芪多糖类化合物的浸出，黄芪多糖得率和纯度随料 液比的增加而增加，但在料液比达到1：5以上后，得率变化不大，溶剂用量为5mLg原料较合适，进一步增加溶剂用量对提取效果变化不大。(2)微波辅助水浸提法最佳工艺验证实验 按各个单因素实验最佳条件提取黄芪多糖，得多糖得率和纯度分别为375、4922，优于单因素实验中的任何一组实验，因此可以确认该方案为最优。244超声波辅助水浸提法(1)实验考察了超声频率一定时超声功率、超声时闯、料液比对提取效果的影响。1、超声功率对多糖得率和纯度的影响 预实验表明，在室温下超声强化水浸提黄芪多糖效果不明显，提高萃取温度可改善多糖提取效果。图2-9为水温度50、水用量为5mLg原料、提取时间60min下，超 声功率对多糖提取效果的影响。结果表明，在超声场中，由于超声形成的空化效应，多 糖的提取效果优于同样条件下无超声强化的水浸提萃取效果；随着超声功率增加，多糖 得率和纯度呈上升趋势，当超声功率达到300W时，进一步增加超声功率，多糖提取效 果改善不明显。图2-9超声功率对多糖得率和纯度的影响Fig29 Effects ofultrasound power oll the yield and purity2、超声时间对多糖得率和纯度的影响图210为提取温度50C，超声功率300 W下，超声作用时间对多糖提取效果的影响。 随着超声作用时问延长，多糖得率和纯度均增加，60min后，增加趋势变缓。18广西大学硕士论文黄芪多糖的提取及分离纯化研究245黄芪多糖水浸提、微波及超声辅助水浸提的比较表2-6为水浸提、微波及超声辅助提取在各自较佳提取条件下，黄芪多糖的得率和 纯度比较。表2-6不同提取方法黄芪多糖提取效果的比较Tab2-6 Comparison ofyield and purity ofasiragalus polysaccharides with different extraction methods由表2-6可看出，传统的水煎煮法提取时间较长，但多糖的得率及纯度高于微波及 超声辅助提取。微波及超声能明显地促进多糖的提取过程，缩短提取时间，特别是微波， 能够在10min内有效地将多糖提取出来，但微波及超声在强化黄芪多糖的提取时，同 时也促进了黄芪中其它成分的提取，多糖纯度低于水煎煮法。分析原因微波能快速促进黄芪细胞中有效活性成分的溶出，可能是交频磁场、电场 作用下，极性分子取向随电场方向改变而变化，从而导致分子旋转、振动或摆动，加剧 反应物分子运动及相线间碰撞频率，使分子在极短时间内达到活化状态，比传统加热方 式均匀、高效，从而加速被萃取成分向萃取溶剂界面扩散；且分子剧烈运动能使细胞壁 破裂和使细胞膜中的酶失去活性，细胞中多糖很容易突破细胞壁和细胞膜障碍而被提取 出来。超声波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超声波的次级效应，如机械振动、 乳化、扩散、击碎，化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有 利于提取。25本章小结(1)本实验通过水浸提法提取黄芪多糖，用苯酚硫酸法测其含量。实验中所作的 标准曲线好，通过体系显色时间实验可知，本