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小鼠骨髓细胞微核试验 InvivoMouseBoneMarrowCytogeneticsTestMicronuleusAssay 食品毒理学 1 一 实验目的 掌握哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的原理和方法了解微核试验的意义及应用 2 二 实验原理 微核 micronucleus 细胞主核之外 大小为细胞直径1 20 1 5圆形或杏仁形 边缘光滑整齐染色与主核一致一个细胞内可以存在一个或多个微核 3 二 实验原理 微核成因染色体或染色单体的无着丝点断片纺锤丝受损而丢失的整个染色体细胞分裂后期遗留在胞质中 单独形成规则的次核 4 植物细胞微核实验 蚕豆根尖 淋巴细胞微核实验双核微核实验小鼠骨髓微核实验 5 嗜多染红细胞 PCE 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞 由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段特点 1 无主核 易识别微核 有核细胞中微核与正常核叶及核的突起难以鉴别 2 胞内含核糖体 染色后成灰蓝色 区别于成熟红细胞 其无核糖体 染色呈淡橘红色 3 骨髓中PCE数量充足 满足实验计数的要求 6 三 意义及应用 检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点 检测能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物 DNA断裂剂和非整倍体诱变剂 辐射损伤 化学诱变剂 新药试验 染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面 7 四 器材及试剂 器材 手术剪 无齿镊 小型弯止血钳 干净纱布 带橡皮头吸管 晾片架 玻璃蜡笔 玻璃染色缸 载玻片及推片 定时钟 带油镜头显微镜 细胞计数器试剂 小牛血清 生理盐水 Giemsa贮备液 8 五 操作步骤 实验动物的选择及处理 动物选择 大 小鼠 小鼠最常用 18 20g 7 12周龄 每组10只 雌雄各半 剂量选择 以1 5LD50为最高剂量组 下设3 4个剂量组 同时设阳性和阴性对照 染毒途径 经口 经皮 经呼吸道 注射 染毒次数 多次染毒法 每天染毒一次 连续4天 第五天取样 两次染毒法 第一次染毒24h后进行第二次染毒 6h取样 9 五 操作步骤 本次实验染毒处理 环磷酰胺剂量 0 8mg 10g每次染毒 腹腔注射 次数 多次染毒法 4次 最佳浓度及作用时间 10 五 操作步骤 骨髓液制备 涂片 染色 观察与计数 11 五 操作步骤 骨髓液制备及涂片猝死 颈椎脱臼 麻醉取组织 胸骨 股骨获取骨髓液 在胎牛血清中迅速制取骨髓液涂片 均匀 12 五 操作步骤 染色涂片充分晾干后染色 1 平置涂片于染色架上 滴加试剂一5滴 迅速均匀盖满涂片 染色1 5min2 不要丢弃试剂一 直接滴加试剂二10滴 轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片 染色8min3 水洗涂片30s 待干后镜检 13 五 操作步骤 观察显微镜的使用低倍镜 细胞群高倍镜 分布均匀 染色良好油镜 细胞形态 微核 14 观察镜下有3种细胞 PCE 灰蓝色NCE 橘黄色有核细胞 蓝紫色微核 蓝紫色 圆形 边缘规则 五 操作步骤 15 五 操作步骤 计数及结果分析1 总共200个细胞中 计数PCE与NCE的比值正常范围0 6 1 2PCE NCE评价细胞毒性的指标P值具有统计学意义 受试化学物剂量过大 PCE形成受到严重抑制 实验结果不可靠2 微核率 含有微核的嗜多染红细胞数 以千分率 表示 若一个PCE中出现两个或两个以上微核 仍按有一个微核细胞计数 16 3 阴性对照组和阳性对照组的微核发生率 根据实验对象的不同 应与相关文献报道或研究历史数据相一致 4 统计分析 Poinsson分布 二项分布 X2检验等 试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时 可认为受试物为具有遗传毒性 17 骨髓微核观察的步骤取胸骨擦净血污 剔去肌肉剪去骨骺端小牛血清混匀 推片晾干Giemsa应用液反面冲洗 晾干细胞计数 18 六 注意事项 骨髓液制备 迅速 在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片及染色 涂片均匀 防止细胞重叠染色层次分明 染液新鲜配制 pH 染色时间 镜下观察 认真识别PCE和NCE正确区分微核和涂片上的杂物显微镜 油镜观察 松柏油 二甲苯 19 镜下观察 正染红细胞 嗜多染红细胞 微核 有核细胞 2