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实验三 血清球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用 二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、 层析技术1. 层析法层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。2. 依据混合物中各组分理化性质的差异分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。3. 基本原理固定相固定不动。流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。4凝胶层析 (凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 基本原理：固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液。 样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出大小分子彼此分开。 影响因素*层析柱的选择及装填： 柱大小分离样品量 凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%5%*凝胶的再生 5. 离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。 固定相：载有大量电荷的离子交换剂； 流动相：具有一定pH值和离子强度的电解质溶液。 其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间吸引力的作用。 当混合物溶液中带有与离子交换剂相反电荷的溶质流经离子交换剂时，后者即对不同溶质进行选择性吸附。 随后，用带有与溶质相同电荷的洗脱液进行洗脱，被吸附的溶质可被置换而洗脱下来，从而达到分离混合物中各种带电荷溶质的目的。【实验思路】盐析法去除清蛋白凝胶层析法脱盐离子交换层析法纯化-球蛋白交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定一、 初步纯化：盐析 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性，使蛋白质从溶液中沉淀析出的方法称为盐析。 盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。 二、凝胶层析脱盐：目的：将大分子的蛋白质与小分子硫酸铵分离开。 固定相：Sephadex G-25流动相：pH6.5 0.02M醋酸盐缓冲液。 三、离子交换层析纯化-球蛋白 固定相：DEAE纤维素（阴离子交换剂）流动相：pH6.5 0.02M醋酸盐缓冲液。四、 浓缩：Sephadex G-25吸水，利用高分子性质。【实验流程】一、初步纯化：盐析取血清1.0ml于小试管中，边摇边缓慢逐滴加入1.0ml pH7.2饱和(NH4)2SO4溶液（边加边摇)。静置5min后，3000rpm/min 离心5min。倾去上清液。沉淀中含有球蛋白。沉淀中加0.5ml洗脱液搅拌溶解，即为粗提的球蛋白溶液。 饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇(逐滴加入！),使用小试管。二、凝胶层析脱盐： 上样：待层析柱上端的液面刚好下降到凝胶表面时（切勿进入空气），将螺旋夹拧紧。再将盐析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入层析柱内（贴壁），打开螺旋夹，收集流出的液体。当蛋白质溶液恰好完全进入凝胶柱内时，用约1ml洗脱缓冲液小心冲洗柱壁上的蛋白质，然后用洗脱缓冲液流洗、收集。 收集与检测：每收集l ml液体时，取一滴收集液用20%磺基水杨酸试之，观察有无蛋白质流出（若有蛋白质则呈现混浊)，如已证明有蛋白质流出时，应另取一试管收集有蛋白质的部分，每收集1ml，换一支试管，并不断用磺基水杨酸试之，直至检查呈阴性为止。三、离子交换层析纯化-球蛋白：上样，收集检测四、sephadex G-25吸水，利用高分子性质。五、鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳 1.基本原理：电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液2.操作步骤点样：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置510分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。通电：接通电源，调节电压为815V/cm，通电约1h，关闭电源，停止电泳。染色：薄膜浸入氨基黑B染色液25分钟。漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗45次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。【注意事项】四、 使用小试管，便于离心。二、硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入三、上样：转圈滴加，起跑线一致四、防止柱上液层干涸（二人配合） 五、洗脱液收集无需分步，用载玻片检测蛋白，约每5滴检测一次，无纳氏试剂六、G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高约0.5ml