针灸对脑瘫痪幼鼠模型行为学的影响及其机制.doc

www.CRTER.org娄元俊，等. 针灸对脑性瘫痪幼鼠模型行为学的影响及其机制针灸对脑性瘫痪幼鼠模型行为学的影响及其机制娄元俊1，刘 阳2，单海军1，曹彩红1，介小素1(1河南中医学院第二附属医院儿童康复科，河南省郑州市 450000；2河南中医学院研究生处，河南省郑州市 450000)引用本文：娄元俊，刘阳，单海军，曹彩红，介小素. 针灸对脑性瘫痪幼鼠模型行为学的影响及其机制J.中国组织工程研究，2016，20(49):7314-7319.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.003 ORCID: 0000-0001-5791-0214(娄元俊)文章快速阅读：醒脑开窍针刺法对脑性瘫痪幼鼠行为学的影响娄元俊，男，1978年生，河南省新乡市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事小儿神经康复方面的研究。通讯作者：刘阳，硕士，讲师，河南中医学院研究生处，河南省郑州市450000中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)49-07314-06稿件接受：2016-09-02正常对照组不作处理。模型组建立脑性瘫痪幼鼠模型，不作任何治疗处理。将24只幼年Wistar大鼠随机分为3组：对照组、模型组、醒脑开窍针灸组，每组8只。治疗24 d后，观察脑性瘫痪幼鼠的体质量变化和前肢功能变化，应用Mortis水迷宫检测幼鼠空间学习记忆能力，酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素6和肿瘤坏死因子因子水平。醒脑开窍针灸组建立脑性瘫痪幼鼠模型，主穴取内关、人中、三阴交，副穴取极泉、尺泽、委中穴进行针刺治疗。文题释义：醒脑开窍针刺法：是天津中医学院第一附属医院石学敏教授所创立的一种治疗中风病的针法，它以传统的中医理论及各家学说为基础，结合现代医学的有关理论，认为中风的基本病理改变为“神窍匿闭”，据此一观点，制定了以“醒脑开窍为主，疏通经络，滋补肝肾为辅”的治疗原则，在此原则指导下治疗中风病的针法，简称“醒脑开窍针刺法”。动物行为学：是研究动物个体和动物社群为适应内外环境变化(刺激)所作出反应的学科。由于行为学研究的是动物的行为，因此，它也被称为“动物行为学”。研究方法为应用Mortis水迷宫检测幼鼠空间学习记忆能力等。摘要背景：醒脑开窍针刺法可以提高脑血流量，降低炎性反应，促进脑组织神经修复，这些作用都能够与脑性瘫痪(简称脑瘫)的治疗方向一致。目的：探讨醒脑开窍针刺法对脑瘫幼鼠行为学的影响和其作用机制。方法：建立脑瘫幼鼠模型，将其随机分为正常对照组、模型对照组、醒脑开窍针刺组；醒脑开窍针刺法主穴取内关、人中、三阴交，副穴取极泉、尺泽、委中穴进行针刺，模型组和正常对照组不做任何处理；治疗24 d后，测量体质量，记录撕除前爪腹侧面胶布的时间，应用Mortis水迷宫检测幼鼠空间学习记忆能力，酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素6和肿瘤坏死因子因子水平。结果与结论：体质量增加率：正常对照组醒脑开窍针刺组模型组，各组之间比较差异有显著性意义(P 醒脑开窍针刺组正常对照组，各组之间比较差异有显著性意义(P 0.05)；水迷宫实验结果：醒脑开窍针刺法能改善脑瘫幼鼠认知能力，减少寻找平台潜伏期和游泳距离，与模型组对比差异有显著性意义(P 0.05)；炎症因子水平：醒脑开窍针刺法组血清肿瘤坏死因子和白细胞介素6水平均有所下降，与模型组对比差异有显著性意义(P acupuncture group model group (P 0.05). (2) The time removing the mackintosh at forepassed center was the longest in the model group, followed by the acupuncture group, and shortest in the control group (P 0.05). (3) Acupuncture method significantly improved the cognitive ability of immature rats, and reduced the latency of searching for platform and swimming distance compared with the model group (P 0.05). (4) The serum levels of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 in the acupuncture group were significantly lower than those in the model group (P 0.05). (5) In conclusion, the acupuncture of “Xingnao Kaiqiao” can improve the symptoms and cognitive ability of the immature rat model of cerebral palsy by up-regulating the serum levels of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6.Subject headings: Cerebral Palsy; Acupuncture; Tumor Necrosis Factor-alpha; Interleukin-6; Tissue EngineeringFunding: the Nursery Engineer of Henan University of Chinese Medicine, No. MP2011-16Cite this article: Lou YJ, Liu Y, Shan HJ, Cao CH, Jie XS. Effect of acupuncture of “Xingnao Kaiqiao” on the behavior of an immature rat model of cerebral palsy and the underlying mechanism. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(49):7314-7319.Lou Yuan-jun, Master, Attending physician, Department of Children Rehabilitation, Henan Province Hospital of TCM, Zhengzhou 450000, Henan Province, ChinaCorresponding author: Liu Yang, Master, Lecturer, School of Graduate of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China7315ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction脑性瘫痪(简称脑瘫)是指从出生前到出生后1个月以内由各种原因所导致的非进行性脑损伤，主要表现为中枢性运动障碍及姿势异常，同时伴有其他异常，如智力低下、语言障碍、癫痫等并发障碍1-2。美国大约有75万不同程度病发的脑瘫患者3。据统计，中国脑瘫患儿发病率约在2.7，并以每年4.6万的速度递增4。以上数据显示，无论是哪个地方，每年都有一定数量的脑瘫患儿出生，而且脑瘫的患病率有逐年增高的趋势，严重威胁新生儿的生命安全和身体健康。目前治疗脑瘫儿童多集中于功能性康复，通过多种手段改善脑瘫病症。中医认为脑瘫的形成跟多种内脏器官有关系，纵观脑瘫的诱因无外乎先天和后天的因素，总体来说与脑、肾、脾、肝，尤与先天之本肾和后天之本脾关系密切5-6。鲍超7认为脑瘫应当分为肝肾不足和气血虚弱2种情况，当施以补益肝肾，配以醒脑开窍的针灸治疗。 醒脑开窍针灸法为石学敏院士所创立，秉承着治疗原则：“醒脑开窍、滋补肝肾为主，疏通经络为辅”8。经过实验研究表明，醒脑开窍针灸法可以改善血液与血管功能的异常，增加缺血区血流量，且促进脑组织的神经修复，这些作用都能够与脑瘫的治疗方向一致。此针灸方法多用于治疗脑梗死，具有提高脑血流量、降低炎性反应发生、改善脑部循环的作用9。研究表明，免疫炎性因子通过复杂的免疫-神经-内分泌网络来影响其他炎性因子的功能和合成，并诱导产生促肾上腺皮质激素，从而起到触发和控制脑损伤后炎症反应的作用。实验建立脑瘫幼鼠模型，对其进行醒脑开窍法针灸治疗能降低血清肿瘤坏死因子和白细胞介素6这些炎症细胞因子的含量，从而改善脑瘫所导致的前肢功能下降以及记忆学习能力障碍，提高认知能力。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2014年7月至2015年7月在河南中医学院第二附属医院实验室完成。1.3 材料1.3.1 实验动物 出生7 d龄、清洁级、健康Wistar大鼠24只，体质量12-14 g，购自河南省实验动物中心。 7 d龄大鼠由母鼠在标准条件下哺乳，光照和黑暗各12 h交替环境中饲养。所有大鼠符合卫生部一级动物标准，得到动物伦理学委员会批准。1.3.2 主要试剂 大鼠肿瘤坏死因子酶联免疫试剂盒(上海酶联生物研究所)；大鼠白细胞介素6酶联免疫试剂盒(美国Aquatic Diagnostics Limited ADL 公司)；戊巴比妥钠(北京贝尔兰科生物科技发展有限公司)；PBS(广州赛业生物技术有限公司)；体积分数为75%乙醇(北海国发海洋生物产业股份有限公司制药厂)；全新滤纸(杭州新华纸业有限公司)。1.3.3 主要仪器和设备 Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟软件有限公司)；电子天平(德国赛多利斯集团SARTORIUS公司)；Biosafer-10TA纯水机(赛飞(中国)有限公司)；电热干燥箱(上海医疗器械总厂)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；BIO-RAD Model550酶联免疫检测仪(日本 BIO-RAD公司)；可调移液枪(Thermo Fisher Scientific公司)；离心机(湘仪仪器有限公司)；磁力搅拌器(常州国华有限公司)。1.4 实验方法1.4.1 动物分组及造模10 将24只幼年大鼠随机分为3组：对照组、模型组、醒脑开窍针灸组，每组8只。建立脑瘫幼鼠模型：除对照组外，其他2组幼鼠经1%戊巴比妥钠麻醉成功后固定到手术板上，消毒颈部皮肤，分离右侧颈总动脉，双重结扎后剪短血管，缝合皮肤，2 h后放置于密闭缺氧箱中，通入体积分数为92%N2和体积分数为8%O2混合气体，3 h后取出，放回母鼠身旁继续哺乳。1.4.2 动物处理 穴位的定位参考实验针灸学11结合人与动物骨度类比。模型建立后第6天，醒脑开窍针灸组主穴取内关、人中、三阴交，副穴取极泉、尺泽、委中6个穴位进行针刺治疗，以直径2 mm，长20 mm的针灸针，先在内关速刺，不留针然后针刺其他穴位，三阴交穴针刺1分深左右，留针10 min，1次/d，10 d为1个疗程，2个疗程间隔2 d，模型组和对照组不做任何处理，共治疗2个疗程。1.4.3 体质量测定和行为学观察 每天测量各组大鼠的体质量，针灸疗程结束后，采用触觉刺激试验，将0.5 cm 0.5 cm的医用胶布粘于各组实验幼鼠两前爪腹侧面，送入观察箱中，记录其撕去胶布所使用的时间。1.4.4 水迷宫实验 自行设计Morris水迷宫数据采集和分析软件，Window95界面操作，不锈钢水槽，支架，有机玻璃平台等。水温保持在(202) ，每天实验后清洗水池，更换清洁水。实验时，平台隐藏在水下(低于水面2 cm)，水迷宫实验结束后提供的主要参数有：潜伏期，路径，初始角度，不同象限的停留时间和长度，搜索策略。从造模开始到第10天，由于动物太小，无法进行检测，从第11天开始，连续检测3 d，然后隔3 d，再连续检测3 d。幼鼠的训练在每天8：00-13：00间进行，方法参照文献12，预先将迷宫任意分为4个象限。平台放入上述4个象限东、南、西、北中随机选择的1个象限中(在训练的1 d中位置一直保持不变)。训练时于池边任意取一入水点，幼鼠面向池壁入水，计算机自动跟踪计时，允许在120 s内找到平台，找到后在平台上保持15 s。若在120 s内找不到，则将幼鼠引导到平台上并保持15 s。每只幼鼠在同一入水点连续训练2次，按照上述方法继续进行第2个入水点、第3个入水点及第4个入水点。每次训练结束后将动物移开、擦干。必要时将大鼠放在150 W的白炽灯下烤5 min，放回笼内。连续3 d训练期间，迷宫周围的参照(包括灯光、周围的器物等)必须保持不变。同时实验者每次将动物放入水中后应立即退出，尽量避免人为因素的干扰。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。1.4.5 血清肿瘤坏死因子和白细胞介素6水平测定 2个治疗疗程结束后，从眼眶静脉丛取血，放置1 h后 3 500 r/min离心10 min，小心用移液枪吸取上清，按照试剂盒说明书进行操作。实验开始前，各试剂均应平衡至室温，防止温度过高使试剂变性；预试验得到样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以测试的样品浓度不超过试剂盒的测量范围，计算时再乘以相应的稀释倍数；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。加样后，37 反应120 min，弃去液体，甩干，加工作液A 100 L，37 反应60 min，弃去孔内液体。洗板5次，甩干，每孔加底物溶液90 L，37 避光30 min进行显色反应，最后加终止液50 L，终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度。1.5 主要观察指标 体质量；撕除前爪腹侧面胶布的时间；水迷宫测试结果；血清肿瘤坏死因子和白细胞介素6水平。1.6 统计学分析 运用SPSS19.0软件进行处理数据，计量资料用s表示，组间数据用随机单位组设计资料的方差分析(two-way ANOVA)，两两之间比较用Tukeys HSD忠实显著性差异检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 参加实验24只幼年Wistar大鼠均进入结果分析，中途无脱落。2.2 各组大鼠的体质量增长情况 治疗24 d后，正常对照组、模型组和醒脑开窍针灸组的大鼠体质量增长率分别为(95.217.35)%、(50.378.23)%、(80.485.76)%。模型组大鼠的体质量比对照组大鼠明显减轻，两组比较差异有显著性意义(P 0.05)，醒脑开窍针灸组大鼠的体质量与模型组比较明显增加(P 0.05)。2.3 行为学测试结果 正常对照组、模型组和醒脑开窍针灸组大鼠撕除胶布的时间分别为(86.7712.10) s、(120.2140.31) s、(90.1210.43) s。模型组撕除胶布的时间明显升高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P 0.05)，用醒脑开窍针灸法治疗后，大鼠撕除胶布的时间明显下降，与模型组比较差异有显著性意义(P 0.05)。2.4 水迷宫测试结果 各组大鼠水迷宫寻找平台的游泳轨迹见图1。正常对照组 模型组 醒脑开窍针灸组图1 各组大鼠水迷宫寻找平台的游泳轨迹Figure 1 The swimming trajectory of searching for platform of rats in each group正常对照组、模型组和醒脑开窍针灸组大鼠在水迷宫入水点寻找水下平台的潜伏期分别为(10.111.32) s、(21.322.43) s、(12.182.98) s，模型组脑瘫幼鼠寻找水下平台所需时间显著性增加，与正常对照组对比差异有显著性意义(P 0.05)，通过醒脑开窍针灸治疗后，所需时间显著性降低，与模型组比较差异有显著性意义(P 0.05)。正常对照组、模型组和醒脑开窍针灸组大鼠在水迷宫入水点寻找水下平台的游泳距离分别为(221.23 100.21) cm、(354.1193.38) cm、(234.5699.90) cm，模型组脑瘫幼鼠寻找水下平台的游泳距离明显增加，与正常对照组对比差异有显著性意义(P 0.05)，醒脑开窍针灸组寻找水下平台的游泳距离与模型组对比明显减少，两组比较差异有显著性意义(P 0.05)，醒脑开窍针灸组寻找水下平台的游泳速度与模型组对比，差异无显著性意义(P 0.05)。2.5 血清肿瘤坏死因子及白细胞介素6水平变化 正常对照组、模型组和醒脑开窍针灸组血清肿瘤坏死因子水平分别为(0.840.23) g/L、(3.210.76) g/L、(1.090.33) g/L，模型组肿瘤坏死因子水平显著性高于正常对照组(P 0.05)；通过醒脑开窍针灸治疗后，肿瘤坏死因子水平与模型组对比显著性降低(P 0.05)。正常对照组、模型组和醒脑开窍针灸组血清白细胞介素6水平分别为(0.990.22) g/L、(3.210.76) g/L、(1.090.33) g/L，模型组白细胞介素6水平显著性高于正常对照组(P 0.05)，醒脑开窍针灸组白细胞介素6水平与模型组对比显著性降低(P 0.05)。3 讨论 Discussion脑瘫产生的原因主要是产前或产时的缺血缺氧，小儿脑瘫属于中医学“五迟”、“五软”、“五硬”、“痿证”等范畴，是儿童致残的主要原因之一。在缺血缺氧时机体有一个自我代偿的过程，胎儿体内血液重新分配，这时候血液主要供给脑组织和心脏。但是当缺血缺氧严重时，超过机体的代偿上限，最先表现的是心肌缺血和心脏搏动功能下降，血液无力向外运输，全身血压下降，整个大脑中的血流速度减慢，使脑血流重新分布。脑组织细胞内线粒体所需的氧气不足，通过糖原的无氧酵解来得到能量，无氧酵解在体内产生过多乳酸，堆积在脑组织中，如此恶性循环，有害于脑细胞的生存环境。幼鼠在发生缺血缺氧后表现出的神经病理特征，如皮质基底神经节感觉下降和海马萎缩的状态与幼儿脑瘫病症相似13-15。人类脑组织缺血缺氧后，在大脑中动脉及脑室周围出现白质软化，在动物实验中，结扎双侧颈总动脉后置于极度缺氧环境中一定时间可以制成缺血缺氧脑瘫模型。最近的研究提示免疫异常可能在脑瘫发病机制中起重要作用16-17。免疫炎性因子参与脑缺血缺氧后炎症反应，通过免疫-神经-内分泌网络来影响其他炎性因子含量，并诱导产生促肾上腺皮质激素，从而加速脑损伤后炎症反应18。肿瘤坏死因子和白细胞介素6均是具有广泛生理学功能的多肽类免疫炎性因子，是机体免疫活动的主要活跃分子，起到调控其他免疫因子的效应19。肿瘤坏死因子在中枢神经系统中可由多种细胞分泌，如星形胶质细胞及小胶质细胞等。研究发现在中枢神经系统受损后，肿瘤坏死因子主要作用于血管内皮细胞，并加剧其损伤20。目前国内外的研究显示肿瘤坏死因子能促进内皮细胞增殖、活化而导致血管通透性增加21-22，也有发现肿瘤坏死因子可诱导人脑组织内皮细胞出现细胞凋亡从而加剧脑部损伤。研究发现肿瘤坏死因子表达上调后可导致血脑屏障通透性明显增 高23，从而炎症细胞更容易进入脑组织，脑瘫病症更加严重。Nishioku等24发现小胶质细胞被激活后可大量释放肿瘤坏死因子，破坏血脑屏障的正常功能。白细胞介素6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生，它可调节多种细胞的生长与分化，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，Qiu等25证明白细胞介素6的细胞毒性作用具有潜在的使神经细胞死亡的可能。白细胞介素6可以由脑内的星形胶质细胞产生，在缺血再灌注模型中发现白细胞介素6含量异常增强，白细胞介素6表达失调可引起许多疾病26。综上所述，肿瘤坏死因子、白细胞介素6等炎性因子能作用于脑组织引起脑瘫病症的病因可能为以下5点：促进对神经元具有毒性的物质的释放，如一氧化氮合酶、自由基和兴奋性氨基酸含量的增加，特别是对发育中的脑组织损害更大27；当母体子宫内感染炎症时，炎性因子会引起系统性的炎症反应直接导致幼儿脑损伤28；当内皮细胞受损后可引起脑部血栓形成，炎性因子通过促使血小板活化和聚集，刺激凝血因子产生，最终损伤脑白质神经元；通过增加血脑屏障的通透性，使外周细菌和致炎性因子进入脑内29，加剧损伤脑组织的作用；孕妇中促前列腺素等物质释放，使分娩提前，导致脑瘫早产儿。在众多细胞因子中，肿瘤坏死因子可对其他细胞如单核细胞等产生刺激，诱导其进一步分泌白细胞介素1及白细胞介素6等因子，或激活B细胞分泌抗体，使机体增加自我免疫能力。实验结果发现脑瘫模型幼鼠血清中肿瘤坏死因子、白细胞介素6等炎性因子含量升高，与文献中描述一致，表明在脑瘫病症中肿瘤坏死因子、白细胞介素6等炎性因子含量的增加有可能进一步导致病症的恶化。针灸治疗脑瘫是中医的一大突破，具有疗效显著、无毒副作用等优点。醒脑开窍针刺法的针刺配方和手法量学操作是科学的，结合现代治疗手法加以改进，是专门用于治疗中风病的针刺方法。现代医学研究表明，醒脑开窍针法通过使脑部血管扩张，增加脑组织供氧和脑血流量，使脑组织缺血后病理的恶性循环模式改变，促使自我保护机制生成，修复神经功能，从而改善脑瘫患儿的病症30-33。实验结果发现，用醒脑开窍针灸治疗可以增加脑瘫大鼠的体质量，加快其撕除前肢胶布的时间，改善脑瘫大鼠的前肢功能障碍和认知能力低下症状。在水迷宫实验中正常对照组及醒脑开窍针灸组大鼠趋向于在有平台的位置搜索，游泳距离及所用时间都较短。因此可以看出：施以醒脑开窍针灸治疗后，脑瘫幼鼠血清炎性因子肿瘤坏死因子、白细胞介素6水平显著性降低，其可能通过减低炎性因子含量减少炎症的发生，从而改善脑瘫症状，影响脑瘫幼鼠的前肢功能和提高认知能力。作者贡献：实验设计为娄元俊，实验实施为娄元俊、刘阳，实验评估为介小素，资料收集为单海军、曹彩红。利益冲突：所有作者共同认可文章内容无相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 骆雄武陈良细,黄玲,等.针灸治疗小儿脑性瘫痪的临床研究J.柳州医学,2004,17(1):29-31.2 El-Shamy SM, Abd El Kafy EM. 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